團(tuán)頭魴phds基因家族參與低氧應(yīng)答的分子機(jī)理解析.pdf

1、團(tuán)頭魴（Megalobrama amblycephala）作為我國(guó)重要淡水養(yǎng)殖魚類，目前面臨著種質(zhì)資源退化以及養(yǎng)殖環(huán)境惡化的問(wèn)題。和四大家魚相比團(tuán)頭魴缺氧耐受能力差，導(dǎo)致其很難適應(yīng)急劇惡化的養(yǎng)殖環(huán)境，尤其是缺氧環(huán)境。另外，團(tuán)頭魴自身性情暴躁、容易受驚，極易對(duì)不良環(huán)境產(chǎn)生應(yīng)激。上述因素極大制約了團(tuán)頭魴養(yǎng)殖的可持續(xù)發(fā)展。因此本研究對(duì)不同溶氧濃度及處理時(shí)間條件下團(tuán)頭魴行為學(xué)、生理生化、非特異性免疫相關(guān)指標(biāo)和環(huán)境應(yīng)激相關(guān)蛋白表達(dá)進(jìn)行了分析;同時(shí)

2、獲得了prolylhydroxylases(phd)家族3個(gè)基因phd1、phd2和phd3序列，并對(duì)phds進(jìn)行生物信息學(xué)、時(shí)空表達(dá)及甲基化水平等分析，為耐低氧團(tuán)頭魴品種/品系的培育提供一定的理論基礎(chǔ)。本研究主要結(jié)果如下:
　　1.低氧處理前后團(tuán)頭魴行為學(xué)變化
　　低氧處理后團(tuán)頭魴呼吸頻率從常氧條件下的平均182次/min增加到平均245次/min，并且魚嘴張合幅度增加，團(tuán)頭魴也從水體底部和中部游到上層水體進(jìn)行水面呼吸(A

3、quatic surface respiration，ASR)。當(dāng)水體溶氧水平繼續(xù)下降并且接近團(tuán)頭魴窒息點(diǎn)溶氧0.5 mg/L時(shí)，團(tuán)頭魴身體失去平衡。復(fù)氧處理后團(tuán)頭魴上述行為也逐漸恢復(fù)到正常狀態(tài)。整體上低氧處理后團(tuán)頭魴自發(fā)性活動(dòng)頻率增加。
　　2.低氧處理前后團(tuán)頭魴生理生化指標(biāo)變化
　　團(tuán)頭魴血紅蛋白、高鐵血紅蛋白、血糖、Na+、琥珀酸脫氫酶和乳酸水平在不同溶氧(dissolved oxygen，DO)濃度包括對(duì)照(DO:5

4、.5 mg/L)以及急性低氧(DO:3.5和1.0 mg/L)處理后，隨著溶氧濃度的下降而逐漸升高，肝糖原水平逐漸下降。
　　團(tuán)頭魴血紅蛋白、高鐵血紅蛋白、血糖和乳酸含量隨著低氧時(shí)間(0.5h和6 h DO:3.5 mg/L)延長(zhǎng)而升高，Na+和肝糖原水平下降，琥珀酸脫氫酶含量不變。復(fù)氧后上述7項(xiàng)指標(biāo)水平全部下降。
　　3.低氧處理前后團(tuán)頭魴非特異性免疫指標(biāo)變化
　　團(tuán)頭魴干擾素alpha和溶菌酶水平隨著溶氧濃度的下降

5、而逐漸升高，而白蛋白水平則逐漸下降。另外，隨著低氧時(shí)間的延長(zhǎng)團(tuán)頭魴干擾素alpha水平升高，而白蛋白和溶菌酶水平則降低。復(fù)氧后上述3項(xiàng)指標(biāo)水平全部升高。
　　4.低氧處理前后團(tuán)頭魴環(huán)境應(yīng)答蛋白的表達(dá)變化
　　Western blot分析顯示Heat shock protein70(Hsp70)在團(tuán)頭魴組織中表達(dá)兩條帶，其中較小的Hsp70條帶通過(guò)hsp70內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)翻譯。較大Hsp70在團(tuán)頭魴肝臟、脾臟、腦、鰓和腎臟

6、中檢測(cè)到表達(dá)，而較小Hsp70僅在肝臟、脾臟和鰓中檢測(cè)到表達(dá)。Hypoxia-inducible factor1alphs(Hif-1α)在團(tuán)頭魴肝臟、脾臟和鰓中的蛋白水平隨著溶氧濃度下降以及低氧處理時(shí)間的增加而升高。
　　5.團(tuán)頭魴phds基因cDNA和啟動(dòng)子擴(kuò)增及序列特征
　　作者設(shè)計(jì)開發(fā)了基于生物信息學(xué)和多重PCR技術(shù)的高效cDNA和啟動(dòng)子擴(kuò)增方案，獲得了團(tuán)頭魴phd1、phd2和phd3的cDNA全長(zhǎng)和啟動(dòng)子序列，該

7、方法也在其他魚蝦中進(jìn)行了有效性驗(yàn)證。
　　生物信息學(xué)分析顯示3個(gè)phds基因均包含5個(gè)外顯子(exons)，編碼的氨基酸序列都含有脯氨酸羥基化酶結(jié)構(gòu)域P4He，該區(qū)域中包含3個(gè)鐵離子結(jié)合位點(diǎn)（氨基酸H、D和H殘基），而Phd2的N末端還有一個(gè)zf-MYND結(jié)構(gòu)域。啟動(dòng)子分析顯示Phd1和phd3啟動(dòng)子中都包含低氧應(yīng)答元件(hypoxia response element，HRE)結(jié)合位點(diǎn)。雙熒光素酶活性進(jìn)一步分析顯示phd3啟動(dòng)子

8、中5個(gè)HRE位點(diǎn)對(duì)Hif-1α做出應(yīng)答，其中HRE1、HRE2和HRE3應(yīng)答活性較強(qiáng)。
　　6.團(tuán)頭魴phds的表達(dá)分析
　　時(shí)空表達(dá)譜分析顯示團(tuán)頭魴phd1在胚胎發(fā)育過(guò)程中的眼囊期表達(dá)量最高;常氧條件下該基因在血液、腦和心臟中表達(dá)較高，但低氧處理后，其在血液、肌肉、腦、心臟和腸表達(dá)下降，在鰓表達(dá)升高。另外，作者也發(fā)現(xiàn)phd1可以通過(guò)選擇不同的起始密碼子而表達(dá)出兩種蛋白，并且兩種蛋白都位于細(xì)胞核中，其中較大蛋白可以促進(jìn)細(xì)胞增

9、殖。
　　團(tuán)頭魴phd2在16-細(xì)胞期、囊胚早期和囊胚中期表達(dá)量較高;常氧條件下該基因在肌肉和鰓表達(dá)最高，低氧處理后其在血液、肝臟、脾臟、肌肉和心臟中的表達(dá)量下降。
　　而團(tuán)頭魴phd3在胚胎發(fā)育的早期表達(dá);常氧條件下該基因在肝臟表達(dá)最高，而低氧后其在所檢測(cè)的9個(gè)組織中都上調(diào)表達(dá)。另外，作者也發(fā)現(xiàn)phd3存在兩種不同的選擇性剪接體，并且這兩個(gè)剪接體都可被低氧誘導(dǎo)表達(dá)。
　　7.TDN-PCR分析團(tuán)頭魴phds甲基化水平

10、
　　團(tuán)頭魴phdl在低氧敏感和耐受個(gè)體的肌肉組織中表達(dá)差異不顯著，phd2在低氧敏感和耐受個(gè)體肌肉組織表達(dá)差異顯著，而phd3在低氧耐受個(gè)體中表達(dá)量較高，在低氧敏感個(gè)體中幾乎檢測(cè)不到表達(dá)。為了分析候選基因啟動(dòng)子的甲基化對(duì)基因表達(dá)的影響，作者設(shè)計(jì)開發(fā)了特異性和靈敏性較高的Touch-down based nest-PCR(TDN-PCR)用于DNA甲基化分析，結(jié)果表明團(tuán)頭魴低氧敏感和耐受個(gè)體的phd2和phd3啟動(dòng)子上CpG區(qū)域沒

11、有甲基化，而phd1啟動(dòng)子上有2個(gè)甲基化區(qū)域。
　　為了進(jìn)一步在團(tuán)頭魴低氧敏感和耐受群體中分析phd1啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化水平，作者利用TDN-PCR技術(shù)的高分辨率溶解曲線(high-resolution melting，HRM)方法對(duì)其進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果顯示團(tuán)頭魴phd1啟動(dòng)子高甲基化程度與低氧敏感群體顯著正相關(guān)。
　　8.TDN-PCR分析魚類phd1甲基化水平
　　通過(guò)TDN-PCR擴(kuò)增來(lái)自鯉形目、鱸形目和鱧形目的幾