團(tuán)頭魴血紅素加氧酶(HO)2重復(fù)基因低氧應(yīng)答分析及PB-Tgf2復(fù)合轉(zhuǎn)座元件的插入誘變研究.pdf

1、團(tuán)頭魴(Megalobrama amblycephala)，鯉科，是我國(guó)重要的淡水養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)魚類，具有養(yǎng)殖成本低、成活率高、生長(zhǎng)快等優(yōu)點(diǎn)，上海海洋大學(xué)也培育出了“浦江1號(hào)”團(tuán)頭魴，具有明顯的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)；但團(tuán)頭魴與鯉魚、鯽魚等魚類相比，表現(xiàn)為極不耐低氧，在實(shí)際大規(guī)模養(yǎng)殖中，容易由于缺氧而引起死亡，給團(tuán)頭魴養(yǎng)殖帶來(lái)極大危害。因此，探索團(tuán)頭魴低氧調(diào)控機(jī)制、發(fā)掘主效基因的功能對(duì)團(tuán)頭魴遺傳育種基礎(chǔ)研究及耐低氧品種的選育都具有重要的實(shí)際應(yīng)用意義。

2、>　　血紅素加氧酶（Heme oxygenase，HO）是血紅素分解代謝過(guò)程中的限速酶，主要功能是分解血紅素產(chǎn)生一氧化碳（CO），亞鐵和膽綠素，隨后膽綠素被還原為膽紅素。本研究采用cDNA末端快速擴(kuò)增（RACE）的方法成功克隆出了團(tuán)頭魴HO-2a和HO-2b基因，并對(duì)團(tuán)頭魴不同發(fā)育時(shí)期的胚胎和成魚的多個(gè)組織進(jìn)行表達(dá)分析，同時(shí)對(duì)不同時(shí)期的胚胎及成魚進(jìn)行低氧處理。序列分析表明，團(tuán)頭魴HO-2a和HO-2b基因cDNA序列全長(zhǎng)分別為1380

3、bp和1390 bp，分別編碼305個(gè)氨基酸（aa）和317 aa；團(tuán)頭魴HO-2a和-2b基因具有相對(duì)較低，67％的相似度，兩者在成魚不同組織中普遍表達(dá)。胚胎發(fā)育時(shí)期，團(tuán)頭魴HO-2a和-2b基因在受精卵中均檢測(cè)到表達(dá)，其中HO-2a mRNA在16hpf處顯著升高并在后期都維持在一個(gè)較高水平，HO-2b mRNA逐漸升高在12hpf時(shí)表達(dá)最高，隨后顯著降低。整胚原位雜交（WISH）結(jié)果顯示：HO-2b mRNA在12hpf時(shí)在中腦和

4、后腦表達(dá)，而此時(shí)期HO-2a mRNA表達(dá)相對(duì)較弱，僅在中腦檢測(cè)到表達(dá)信號(hào)，在24和36hpf胚胎時(shí)期，HO-2a和-2b mRNAs都在眼部和腦部表達(dá)。急性低氧處理實(shí)驗(yàn)中，HO-2a和-2b mRNAs在腦中相對(duì)對(duì)照組均顯著上升，但是在鰓和肝臟中呈明顯下降趨勢(shì)，HO-2a mRNA在心臟中顯著上升而HO-2b mRNA在心臟中顯著下降；并且，本實(shí)驗(yàn)表明低氧狀態(tài)下HO-2a和-2b mRNAs在不同發(fā)育時(shí)期的胚胎中能夠被強(qiáng)烈誘導(dǎo)表達(dá)，這

5、些結(jié)果都給我們?cè)贖O-2基因功能的保守與分化及低氧應(yīng)答方面提供新的視角。
　　同時(shí)，隨著近些年轉(zhuǎn)座子的應(yīng)用廣泛，在功能基因的獲得和研究方面具有其獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)，本研究采用實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的PiggyBac-Tgf2復(fù)合轉(zhuǎn)座元件和輔助質(zhì)粒pCS2-PBTP，通過(guò)共顯微注射到團(tuán)頭魴受精卵中，探究該復(fù)合轉(zhuǎn)座元件在團(tuán)頭魴中的插入誘變、轉(zhuǎn)座效率及獲得轉(zhuǎn)基因團(tuán)頭魴等相關(guān)數(shù)據(jù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，注射復(fù)合PB-Tgf2轉(zhuǎn)座元件的受精卵陽(yáng)性表達(dá)率為62.26%，