草魚肌肉生長抑制素2的克隆、功能分析以及Tgf2轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的魚類插入誘變研究.pdf

1、草魚(Ctenopharyngodon idellus)是我國四大家魚之一,年產(chǎn)量接近400萬噸,其研究很受重視。而草魚肌肉作為草魚的主要食用部位,其生長和發(fā)育調(diào)控的研究逐漸成為研究的熱點。myostatin基因編碼 MSTN蛋白,是高等脊椎動物(如小鼠和畜禽)肌肉生長的關(guān)鍵性負性調(diào)控因子,該基因?qū)ν瑢偌棺祫游锏挠补囚~類肌肉的生長發(fā)育也可能扮演著重要的作用。在高等脊椎動物中只發(fā)現(xiàn)存在1個 MSTN基因即 mstn1,而在有些魚類中不僅存

2、在 mstn1,還存在第2個 mstn2基因。在草魚中,是否存在 mstn2基因及其在草魚肌肉生長發(fā)育過程中的功能目前尚不清楚。
　　本研究在草魚中克隆到了 MSTN2 cDNA,全長為1976bp,可編碼364個氨基酸。胚胎不同時期的RT-PCR結(jié)果顯示,MSTN2 mRNA在草魚胚胎發(fā)育各階段均有表達,但早期表達量較低,中后期表達量逐步升高。在草魚早期胚胎的原位雜交中沒有檢測到信號,而在草魚胚胎發(fā)育的中期,腦和脊索中可檢測到微

3、弱表達,在后期胚胎中表達信號增強。RT-PCR結(jié)果顯示,MSTN2 mRNA在草魚腦、肌肉、性腺、肝臟和眼中均有表達,其中在腦中表達量較高,而在其它組織中則沒有表達。在受精卵中顯微注射 MSTN2的5’加帽 mRNA對草魚胚胎的早期發(fā)育影響不大,但后期草魚胚胎體形扭曲、尾巴彎曲,并呈現(xiàn)出明顯的畸形;對過表達36h后的草魚胚胎用肌肉發(fā)育相關(guān)的myoD,myoG,ntl探針進行原位雜交,發(fā)現(xiàn) MSTN2的增加可造成草魚肌節(jié)扭曲膨大、體軸彎曲

4、及肌肉發(fā)育障礙。這些結(jié)果表明,與 MSTN1基因類似,草魚 MSTN2對草魚的肌肉生長發(fā)育也起著重要的調(diào)控作用?；贛STNs對草魚肌肉生長起著明顯的抑制作用,本研究還進一步開展了 MSTN1基因反義 mRNA敲降的初步研究。利用我們自主開發(fā)的鯉科魚類 Tgf2轉(zhuǎn)座子,構(gòu)建了 MSTN1的反義敲降載體—pTgf2-EF1α-antimstn1,通過與編碼轉(zhuǎn)座酶的輔助質(zhì)粒共同顯微注射到草魚、鯽魚和團頭魴的受精卵(1-2細胞期)中,以獲得反

5、義 mstn1表達的轉(zhuǎn)基因后代,從而實現(xiàn)內(nèi)源性 mstn1基因的敲降。初步的研究結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)反義 mstn1的陽性魚比非轉(zhuǎn)基因的陰性魚體重增加顯著(P<0.05),表明了草魚 mstn基因在草魚肌肉生長發(fā)育中的負調(diào)控作用。
　　本文還開展了 Tgf2轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的魚類插入誘變研究。以 Tgf2轉(zhuǎn)座子為基礎(chǔ),分別構(gòu)建了帶有4種不同啟動子的供體質(zhì)?！猵Tgf2-EF1α-eGFP、pTgf2-Krt8-eGFP、pTgf2-βacti

6、n-eGFP和pTgf2-MyoD-eGFP,以及輔助質(zhì)粒 pCS2-β-actin-gfTP,將供體質(zhì)粒和輔助質(zhì)粒或轉(zhuǎn)座酶 mRNA共同注射到草魚、鯽和團頭魴的受精卵中,初步建立了一個轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的插入誘變庫。研究結(jié)果顯示,在鯽和團頭魴的早期胚胎中,熒光率達到90％,在草魚中則達到95%。隨著注射的供體質(zhì)粒的不同,表現(xiàn)出不同的熒光特征——肌肉熒光、表皮熒光及全身熒光,eGFP在平游期的整合率平均為53%,在1齡階段的整合率在35%左右。