斑馬魚活性Tc1轉(zhuǎn)座子的挖掘及驗(yàn)證.pdf

1、轉(zhuǎn)座子廣泛分布于細(xì)菌、真菌及昆蟲等各種生物中，是一種可以在基因組內(nèi)移動(dòng)的DNA元件，在轉(zhuǎn)基因和基因治療等領(lǐng)域具有很好的應(yīng)用前景。目前國際上轉(zhuǎn)座子的研發(fā)和應(yīng)用研究取得顯著進(jìn)展，如PB、SB、Tol2等轉(zhuǎn)座子已經(jīng)作為基因治療和轉(zhuǎn)基因的介導(dǎo)載體得到廣泛應(yīng)用，但國內(nèi)自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的轉(zhuǎn)座子研發(fā)相對(duì)滯后。
　　本研究通過斑馬魚基因組上DNA轉(zhuǎn)座子挖掘，并經(jīng)過脊椎動(dòng)物細(xì)胞和胚胎水平驗(yàn)證，獲得高活性ZB轉(zhuǎn)座子，為動(dòng)物轉(zhuǎn)基因、功能基因組學(xué)（基因捕獲等

2、）和基因治療等研究提供具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的遺傳操作工具。主要研究內(nèi)容如下:
　　(1)通過生物信息學(xué)分析，在斑馬魚基因組中發(fā)現(xiàn)5個(gè)結(jié)構(gòu)完整的Tc1/Mariner家族DNA轉(zhuǎn)座子。遺傳分化比較表明，其中1個(gè)轉(zhuǎn)座子活性最強(qiáng)，是年輕轉(zhuǎn)座子，命名為ZB。完整ZB轉(zhuǎn)座子全長1.4kb，兩端各有一個(gè)對(duì)稱的203bp的末端反向重復(fù)序列，中間含有1026bp的轉(zhuǎn)座酶基因編碼序列。斑馬魚基因組中至少存在21個(gè)ZB拷貝，其中16個(gè)為完整的拷貝，DNA

3、序列和ORF的氨基酸序列的同源性分別為99.80％和99.47％。ZB兩端的TIR序列相似性達(dá)100％。其ORF含有Tc1轉(zhuǎn)座子典型的保守結(jié)構(gòu)域（如HTH、NLS、DD34E等）。
　　(2)經(jīng)過qPCR和原位雜交檢測表明，ZB轉(zhuǎn)座酶的正反轉(zhuǎn)錄子在斑馬魚在所檢測的11階段都有表達(dá)，且表達(dá)強(qiáng)度隨著時(shí)間的增加而升高。在成年斑馬魚大腦、心臟、肌肉、睪丸和卵巢組織中表達(dá)存在差異，且在大腦中表達(dá)量最高，在心臟、睪丸和卵巢組織較低。
　

4、　(3)為驗(yàn)證ZB在哺乳動(dòng)物細(xì)胞上的活性，克隆ZB轉(zhuǎn)座子的上下游TIR轉(zhuǎn)座元件和轉(zhuǎn)座酶ORF，分別構(gòu)建成框架載體pZB-Msc和轉(zhuǎn)座酶輔助質(zhì)粒(pCMV-ZB)。再將含有新霉素性基因表達(dá)盒(PGK-NEO)克隆至轉(zhuǎn)座子框架載體pZB-Msc，形成轉(zhuǎn)座子供體質(zhì)粒pZB-PGK-NEO，然后將轉(zhuǎn)座子(pZB-PGK-NEO)和轉(zhuǎn)座酶以不同質(zhì)量比共轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞，并與PB、SB和Tol2轉(zhuǎn)座子進(jìn)行比較。試驗(yàn)結(jié)果表明4種轉(zhuǎn)座子實(shí)驗(yàn)組表達(dá)新霉素

5、抗性基因的細(xì)胞數(shù)量均高于對(duì)照組，且ZB轉(zhuǎn)座子體統(tǒng)在1∶1質(zhì)量比時(shí)含抗性的細(xì)胞數(shù)量最多，即轉(zhuǎn)座效率最高。ZB在10∶1，2∶1，1∶1，1∶2質(zhì)量比時(shí)，抗性細(xì)胞數(shù)量高于SB轉(zhuǎn)座子，且在1∶1時(shí)差異明顯(P＜0.01)。ZB的轉(zhuǎn)座效率可以與PB媲美，高于SB和TOL2（P＜0.05）。
　　(4)為驗(yàn)證ZB在斑馬魚胚胎上的轉(zhuǎn)座活性，將含有鯉魚beta-actin啟動(dòng)子和GFP基因的綠色熒光蛋白表達(dá)盒(FAG-GFP)分別克隆至轉(zhuǎn)座子框

6、架載體pZB-Msc，形成轉(zhuǎn)座子供體質(zhì)粒，然后將轉(zhuǎn)座子（含F(xiàn)AG-GFP表達(dá)盒）和轉(zhuǎn)座酶mRNA共注射斑馬魚一細(xì)胞期胚胎，注射后觀察熒光，比較4種轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座效率，試驗(yàn)結(jié)果表明，在注射后24hpf和5dpf的GFP陽性率ZB轉(zhuǎn)座子均高于其它3種轉(zhuǎn)座子，且顯著高于SB轉(zhuǎn)座子(P＜0.05)。
　　(5)為驗(yàn)證ZB在小鼠胚胎上的轉(zhuǎn)座活性，將含有雞beta-actin啟動(dòng)子和GFP基因的綠色熒光蛋白表達(dá)盒(CAG-GFP)克隆至轉(zhuǎn)座子框

7、架載體pZB-Msc，形成轉(zhuǎn)座子供體質(zhì)粒，然后將轉(zhuǎn)座子（含CAG-GFP表達(dá)盒）和轉(zhuǎn)座酶共注射小鼠受精卵，注射后胚胎發(fā)育至囊胚期觀察熒光，每組重復(fù)三次，試驗(yàn)結(jié)果顯示3組胚胎均有熒光，加轉(zhuǎn)座酶質(zhì)粒組、轉(zhuǎn)座酶mRNA組和未加轉(zhuǎn)座酶組的胚胎陽性率分別為31.76％(n=110)、33.43％(n=147)和4.34％(n=162)，加轉(zhuǎn)座酶組的胚胎陽性率均顯著高于未加轉(zhuǎn)座酶組(P＜0.05)，加轉(zhuǎn)座酶組的胚胎陽性率之間差異不顯著(P＞0.05