金魚Tgf2轉(zhuǎn)座子的研究及其轉(zhuǎn)基因應(yīng)用.pdf

1、轉(zhuǎn)座子是基因組上的一段一定長(zhǎng)度的DNA序列，能在自身編碼的轉(zhuǎn)座酶或逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下，發(fā)生自我剪切或復(fù)制，并且在基因組DNA中移動(dòng)位置的基本單位。如青鳉Tol2轉(zhuǎn)座子(TransposableelememofOryziaslatipes，number2)和鮭魚SB轉(zhuǎn)座子(SleepingBeautyTransposon)都以“剪切-粘貼”的方式進(jìn)行轉(zhuǎn)座，即轉(zhuǎn)座酶對(duì)轉(zhuǎn)座子進(jìn)行剪切，然后介導(dǎo)其插入到基因組內(nèi)部。研究證明Tol2轉(zhuǎn)座酶識(shí)別的是轉(zhuǎn)

2、座子末端反向重復(fù)序列和亞末端重復(fù)序列，當(dāng)上述區(qū)域突變之后，其轉(zhuǎn)座效率會(huì)明顯下降。SB轉(zhuǎn)座酶識(shí)別的末端重復(fù)序列大約長(zhǎng)230bp，由外側(cè)的反向重復(fù)序列(invertedrepeats，IR)和內(nèi)側(cè)的同向重復(fù)序列(directlyrepeats，DR)及兩者間的序列組成。根據(jù)它們的轉(zhuǎn)座機(jī)制，國(guó)外學(xué)者構(gòu)建了基于Tol2和SB轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)，即轉(zhuǎn)基因供體質(zhì)粒加轉(zhuǎn)座酶輔助質(zhì)粒的轉(zhuǎn)基因體系。研究表明，兩個(gè)轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)都具有廣泛的通用性，近幾年已在轉(zhuǎn)

3、基因、基因捕獲和基因治療研究中取得了重大進(jìn)展。
　　 2008年，本實(shí)驗(yàn)室在19種不同魚類物種或品系中進(jìn)行PCR篩選，最后在我國(guó)金魚品系中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的hAT家族轉(zhuǎn)座子，命名為金魚Tgf2轉(zhuǎn)座子。在此基礎(chǔ)上，本研究進(jìn)一步采用cDNA末端快速擴(kuò)增法(RACE)克隆了Tgf2轉(zhuǎn)座酶全長(zhǎng)cDNA，并對(duì)其表達(dá)進(jìn)行了RT-PCR和原位雜交研究；其后，對(duì)Tgf2轉(zhuǎn)座子的多態(tài)性進(jìn)行了研究；最后，利用Tgf2轉(zhuǎn)座子的左右末端和轉(zhuǎn)座酶編碼框(CD

4、S)構(gòu)建了具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)，并在斑馬魚、草魚、金魚和鯽魚等鯉科魚類中開展了轉(zhuǎn)基因研究。主要研究結(jié)果如下：
　　 1.Tgf2轉(zhuǎn)座酶全長(zhǎng)cDNA的克?。汗部寺〉玫?種轉(zhuǎn)錄本，分別命名為gfTP-1、gfTP-2、gfTP-3、gfTP-4、gfTP-5、gfTP-6、gfTP-7；經(jīng)對(duì)其編碼框進(jìn)行預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)金魚Tgf2轉(zhuǎn)座子能編碼產(chǎn)生3種長(zhǎng)度的轉(zhuǎn)座酶，其編碼框長(zhǎng)度分別為：2061bp(gfTP-1)、1953bp(gf

5、TP-2和gfTP-3)和1734bp(gfTP-4、gfTP-5、gfTP-6和gfTP-7)，分別編碼686個(gè)、650個(gè)和577個(gè)氨基酸殘基；金魚Tgf23種長(zhǎng)度的轉(zhuǎn)座酶間的差異主要體現(xiàn)在5’端，與青鳉Tol2的3種轉(zhuǎn)座酶序列相比較，發(fā)現(xiàn)兩種魚類的轉(zhuǎn)座酶在序列上的相似度達(dá)99％，僅有7個(gè)氨基酸的差異。
　　 2.選取3種長(zhǎng)度金魚Tgf2轉(zhuǎn)座酶mRNA的共有區(qū)設(shè)計(jì)引物，對(duì)金魚不同組織總RNA進(jìn)行RT-PCR分析，結(jié)果顯示Tgf

6、2轉(zhuǎn)座酶基因在金魚所有組織均有表達(dá)，以卵巢中表達(dá)量最高，其次為肝臟。對(duì)金魚不同發(fā)育時(shí)期胚胎進(jìn)行RT-PCR和整胚原位雜交分析，結(jié)果表明轉(zhuǎn)座酶基因的表達(dá)模式在不同個(gè)體問具有明顯時(shí)空差異。
　　 3.對(duì)珍珠、鶴頂紅、紅獅頭、花獅頭、琉金、蝶尾、龍睛、水泡眼和草金9個(gè)不同金魚品系的基因組進(jìn)行PCR分析，發(fā)現(xiàn)Tgf2轉(zhuǎn)座子在金魚各品系中均有分布；并揭示了在金魚基因組中，Tgf2轉(zhuǎn)座子既有完整拷貝也有包含缺失的拷貝。
　　 4.克

7、隆了Tgf2轉(zhuǎn)座子的220bp左末端和185bp右末端序列，并以此構(gòu)建了基于Tgf2轉(zhuǎn)座子的pTgf2-eflα-eGFP、pTgf2-krt8-eGFP和pTgf2-eflα-RFP轉(zhuǎn)基因供體質(zhì)粒；同時(shí)，利用Tgf2轉(zhuǎn)座酶1734bp的編碼區(qū)(編碼577個(gè)氨基酸殘基)構(gòu)建了轉(zhuǎn)座酶輔助質(zhì)粒pCS2-gfTP。利用上述構(gòu)建的轉(zhuǎn)基因供體質(zhì)粒和輔助質(zhì)粒系統(tǒng)，在模式生物斑馬魚和常見養(yǎng)殖鯉科魚類草魚、鯽魚及金魚中進(jìn)行了轉(zhuǎn)基因研究。結(jié)果表明：Tgf