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文檔簡介
1、轉(zhuǎn)座子(Transposon,Tn),是在生物界廣泛分布的,能夠在基因組上自主復(fù)制和轉(zhuǎn)移的一段DNA序列。轉(zhuǎn)座子能夠有效介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移,在轉(zhuǎn)基因和基因捕獲等研究中具有很高的應(yīng)用價(jià)值。目前已經(jīng)分離到很多高活性DNA轉(zhuǎn)座子,如PiggyBac(PB)轉(zhuǎn)座子、Sleepingbeauty(SB)轉(zhuǎn)座子和Tol2轉(zhuǎn)座子等,并已經(jīng)在斑馬魚、小鼠、線蟲等模式生物的轉(zhuǎn)基因和基因捕獲等研究中得到廣泛應(yīng)用,但目前對(duì)PB、SB和Yol2轉(zhuǎn)座子在斑馬魚中的轉(zhuǎn)座
2、特性仍然缺乏深入了解。本研究系統(tǒng)比較了目前研究應(yīng)用最為廣泛的PB、SB和Tol2三種DNA轉(zhuǎn)座子在斑馬魚中的基因轉(zhuǎn)移和基因捕獲效率差異,為轉(zhuǎn)座子在相關(guān)領(lǐng)域的研究和應(yīng)用提供參考。本實(shí)驗(yàn)主要包括:
1、為比較PB、SB、Tol2轉(zhuǎn)座子的基因轉(zhuǎn)移效率差異,將含有鯉魚的beta-actin啟動(dòng)子(命名為FAG)和綠色熒光蛋白報(bào)告基因(Green Fluorecent Protein,GFP)表達(dá)盒(FAG-GFP)分別克隆至PB、SB
3、、Tol2轉(zhuǎn)座子框架內(nèi),構(gòu)建成pPB-FAG-GFP、pSB-FAG-GFP、pTol2-FAG-GFP轉(zhuǎn)基因載體。然后將3個(gè)載體分別與SB,PB及Tol2轉(zhuǎn)座酶mRNA按照5個(gè)質(zhì)量比20ng∶10ng,20ng∶30ng,20ng∶50ng,20ng∶80ng,20ng∶100ng注射斑馬魚胚胎,獲得3個(gè)轉(zhuǎn)座子和轉(zhuǎn)座酶最佳注射質(zhì)量比例。其中SB和PB為20ng∶50ng,Tol2為20ng∶30ng。再以最佳注射比例注射斑馬魚胚胎,分
4、別在48hpf和120hpf檢測(cè)的斑馬魚F0代胚胎的GFP陽性率,結(jié)果表明:48hpf和120hpf檢測(cè)的斑馬魚胚胎中,Tol2的GFP陽性分別為68%和68%(N=872),高于PB(66%和68%,N=885)和SB(64%和65%,N=897),但三者差異不顯著(P>0.05); F0代GFP陽性個(gè)體飼養(yǎng)至成年后與野生型個(gè)體交配獲得F1代,對(duì)F1代的GFP檢測(cè)表明:Tol2組的生殖系傳遞效率最高為46.07%(NF0=231),高
5、于PB組的17.86%(NF0=212)和SB組的13.41%(NF0=199)。
2、為比較PB、SB、Tol2轉(zhuǎn)座子的增強(qiáng)子捕獲效率差異,將含有斑馬魚krt4基因的基礎(chǔ)啟動(dòng)子和綠色熒光蛋白報(bào)告基因(GFP)的表達(dá)盒(Krt4-GFP)分別克隆至3個(gè)轉(zhuǎn)座子框架中,構(gòu)建成:pPB-Krt4-GFP、pSB-Krt4-GFP、pTol2-Krt4-GFP增強(qiáng)子捕獲載體。將3個(gè)載體分別與SB,PB及Yol2轉(zhuǎn)座酶mRNA,按照上文
6、優(yōu)化的最佳比例注射斑馬魚胚胎,分別在48hpf和120hpf檢測(cè)斑馬魚F0代胚胎的GFP陽性率,結(jié)果表明:Tol2組增強(qiáng)子捕獲效率最高,48hpf和120hpf時(shí)分別為90.45%和92.71%(N=1524),顯著高于PB組(83.18%和83.32%,N=1276),Tol2組在48hpf高于SB組(88.64%,N=1378),但差異不顯著(P>0.05),在120hpf時(shí)顯著高于SB組(88.87%,N=1378)(P<0.05
7、)。F0代GFP陽性個(gè)體飼養(yǎng)至成年后與野生型個(gè)體交配獲得F1代,對(duì)F1代的GFP檢測(cè)表明:Tol2組生殖系傳遞效率最高達(dá)到55.56%(NF0=165),高于PB組的32.56%(NF0=149)和SB組38.36%(NF0=151); F1代斑馬魚表達(dá)模式分布分析表明:Tol2能產(chǎn)生最多的單個(gè)表達(dá)模式的后代,PB則能產(chǎn)生更多表達(dá)模式的后代,SB趨于兩者之間。
3、為比較內(nèi)部核糖體插入位點(diǎn)(Intemal Ribosome E
8、ntry Site,IRES)元件對(duì)轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的基因捕獲效率的影響,將IRES元件插入pTol2-RG-Trap基因捕獲載體的PolyA捕獲構(gòu)件的下游,構(gòu)建成pTol2-GTrap。以不含IRES元件的pTol2-RG-Trap基因捕獲載體為對(duì)照,分別將pTol2-GTrap和pTol2-RG-Trap兩個(gè)載體與Tol2轉(zhuǎn)座酶mRNA,注射斑馬魚胚胎,分別在48hpf和120hpf檢測(cè)斑馬魚F0代胚胎的GFP陽性率,結(jié)果表明:pTol2
9、-GTrap組在48hpf和120hpf的胚胎GFP陽性率分別為74.93%和73.91%(N=986),顯著高于pTol2-RG-Trap組(41.86%和41.04%,N=853)(P<0.05)表明IRES元件能夠提高基因捕獲效率。
4、為比較PB、SB、Tol2轉(zhuǎn)座子的基因捕獲效率差異,以構(gòu)建成pTol2-GTrap為基礎(chǔ),分別用PB和SB轉(zhuǎn)座子框架替換Tol2框架,構(gòu)建成pPB-GTrap和pSB-GTrap。將3個(gè)
10、載體分別與SB,PB及Tol2轉(zhuǎn)座酶mRNA,按照最優(yōu)比例注射斑馬魚胚胎,分別在48hpf和120hpf檢測(cè)斑馬魚F0代胚胎的GFP陽性率,結(jié)果表明:Tol2組基因捕獲效率最高(74.93%和73.91%,N=986),顯著高于SB組(66.07%和64.02%,N=1025)和PB組(54.23%和53.26%,N=976),且SB和PB之間差異也達(dá)到顯著水平(P<0.05)。
綜上所述,本研究表明:在斑馬魚中,Tol2轉(zhuǎn)座
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