團(tuán)頭魴低氧應(yīng)答相關(guān)mir-462-731表達(dá)及其功能初探.pdf

1、團(tuán)頭魴（Megalobrama amblycephala）俗稱(chēng)武昌魚(yú)(Wuchang bream)，屬于鯉形目（Cypriniformes），鯉科（Cyprinidae），鲌亞科（Cultrinae），魴屬（Megalobrama），具有食性廣、生長(zhǎng)快、生產(chǎn)成本低、成活率高等優(yōu)點(diǎn)，是僅存于我國(guó)的一種重要淡水經(jīng)濟(jì)魚(yú)類(lèi)。
　　MicroRNAs（miRNAs）是廣泛存在于真核生物中的一類(lèi)內(nèi)源性的具有轉(zhuǎn)錄水平和轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控功能的非編碼

2、小RNA，幾乎涉及目前已知的所有生物學(xué)過(guò)程，包括生長(zhǎng)、發(fā)育、增殖分化、凋亡、腫瘤發(fā)生發(fā)展等。已有大量研究表明一些低氧調(diào)節(jié)miRNAs(hypoxia-regulated microRNAs，HRMs)參與低氧應(yīng)答過(guò)程。目前關(guān)于魚(yú)類(lèi)低氧適應(yīng)的miRNAs報(bào)道較少。本研究分析了硬骨魚(yú)類(lèi)特有的miRNA簇miR-462/731的序列特征及同源性，團(tuán)頭魴miR-462/731的時(shí)空表達(dá)譜。此外，在體外構(gòu)建一系列miR-462/731簇上游低氧相

3、關(guān)HRE(hypoxia responseelement)位點(diǎn)的啟動(dòng)子重組載體，分析不同HRE位點(diǎn)在低氧條件下的轉(zhuǎn)錄活性，為進(jìn)一步探究miRNAs在魚(yú)類(lèi)低氧調(diào)控中的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
　　主要研究結(jié)果如下:
　　1.硬骨魚(yú)類(lèi)miR-462和miR-731成熟序列分析
　　本研究擴(kuò)增出團(tuán)頭魴miR-462/731成熟序列。與其他9種硬骨魚(yú)的miR-462/731成熟序列以及人的miR-191/425序列進(jìn)行多序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)

4、其種子序列的高度保守性。進(jìn)化樹(shù)分析表明，硬骨魚(yú)類(lèi)的miR-462和miR-731序列的保守性很高，且聚為兩個(gè)不同的分支;對(duì)于miR-462序列，團(tuán)頭魴與草魚(yú)聚為一小支，再與其他魚(yú)類(lèi)聚為一大支;對(duì)于miR-731，團(tuán)頭魴與草魚(yú)、斑馬魚(yú)和鯉等鯉科魚(yú)類(lèi)聚為一個(gè)小支，這些結(jié)果說(shuō)明草魚(yú)與團(tuán)頭魴的進(jìn)化關(guān)系最近。
　　2.硬骨魚(yú)類(lèi)miR-462/731上游序列的生物信息學(xué)分析
　　本研究擴(kuò)增出團(tuán)頭魴miR-462/731上游啟動(dòng)子候選區(qū)域

5、(-2500bp)，預(yù)測(cè)出3個(gè)HRE位點(diǎn)。與其他硬骨魚(yú)類(lèi)的miR-462/731上游序列的生物信息學(xué)分析表明，啟動(dòng)子中均包含多個(gè)預(yù)測(cè)的啟動(dòng)子序列，如TATA框，HRE，ISRE，PU.1等，表明miR-462/731上游調(diào)控序列具有高度保守性，提示可能參與重要的調(diào)控功能。另外，對(duì)miR-462/731的基因組位置的同線(xiàn)性分析發(fā)現(xiàn)，硬骨魚(yú)的miR-462/731序列均位于impdh2（inosine monophosphate dehyd

6、rogenase2，肌苷5‘-單磷酸脫氫酶2）和dalrd3（DALR anticodon binding domain containing3）基因之間。
　　3.團(tuán)頭魴miR-462/731的時(shí)空表達(dá)及低氧處理?xiàng)l件下的表達(dá)分析
　　本研究對(duì)團(tuán)頭魴miR-462/731進(jìn)行qRT-PCR時(shí)空表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，在胚胎發(fā)育的不同時(shí)期，這兩個(gè)miRNAs均在神經(jīng)胚期的表達(dá)量最高，而在胚胎發(fā)育早期，表達(dá)量較低，之后逐漸上升，推測(cè)miR

7、-462/731在團(tuán)頭魴的胚胎發(fā)育中晚期發(fā)揮重要功能。miR-462/731在鰓中表達(dá)量最高，而在血液、肝臟和性腺的表達(dá)量較低，說(shuō)明其在鰓中參與重要的調(diào)控功能。在低氧條件下，miR-462/731在血液中均呈現(xiàn)上調(diào)表達(dá)，而在其他組織中的表達(dá)量均下降，推測(cè)在低氧條件下，血液中miR-462/731參與低氧應(yīng)答調(diào)控。體外CoCl2模擬低氧處理MAF細(xì)胞分析團(tuán)頭魴miR-462/731的表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，這兩個(gè)miRNAs均是在100μM CoC

8、l2處理后48h表達(dá)量達(dá)到最大值。
　　4.團(tuán)頭魴miR-462/731啟動(dòng)子缺失體的構(gòu)建和活性分析
　　對(duì)團(tuán)頭魴miR-462/731上游預(yù)測(cè)到的3個(gè)HRE位點(diǎn)進(jìn)行體外熒光素酶活性分析發(fā)現(xiàn)，與陰性對(duì)照PGL3-Basic質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組相比，PGL3-1HRE，PGL3-2HRE，以及PGL3-3HRE質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組的熒光素酶活性均明顯升高，說(shuō)明啟動(dòng)子缺失體PGL3-1HRE（-2105bp至-1765bp）可能包含正調(diào)控元件。用1

9、00μM CoCl2處理轉(zhuǎn)染過(guò)重組載體的細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，僅啟動(dòng)子缺失體PGL3-1HRE的活性顯著增加，推測(cè)該HRE位點(diǎn)(CCACGTAT)可能是參與低氧應(yīng)答的重要作用元件。
　　5.團(tuán)頭魴miR-462/731對(duì)細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期的影響
　　將miR-462和miR-731模擬物分別轉(zhuǎn)染到團(tuán)頭魴鰭條細(xì)胞中，檢測(cè)其對(duì)細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期的影響，結(jié)果顯示，miR-462/731可抑制細(xì)胞增殖，且通過(guò)抑制細(xì)胞周期的G2期進(jìn)而抑制細(xì)胞周期