鳊魴魚類微衛(wèi)星DNA指紋圖譜的構(gòu)建、遺傳結(jié)構(gòu)分析和團頭魴fgfr1基因的克隆與功能研究.pdf

1、團頭魴（Megalobrama amblycephala）是我國特有的養(yǎng)殖魚類，在我國淡水養(yǎng)殖業(yè)及淡水捕撈業(yè)中占有重要的經(jīng)濟地位。團頭魴具有養(yǎng)殖成本低、生長快、成活率高、易捕撈，肉質(zhì)好等優(yōu)點，在我國廣受青睞。發(fā)掘其生長發(fā)育相關(guān)主效基因，培育優(yōu)良品種，是水產(chǎn)動物遺傳育種基礎(chǔ)研究的重要內(nèi)容。然而，當(dāng)前以團頭魴為首的鳊魴魚類天然資源已衰退嚴(yán)重，其基因庫也受到了威脅。另外，鳊魴魚類由于地理分布上的疊加，形態(tài)和生活習(xí)性較為相近，在自然條件下有可能

2、相互交配，從而造成種質(zhì)混雜，原種鑒別日益迫切。
　　成纖維生長因子受體（fibroblast growth factor receptor1，F(xiàn)gfr1）屬于Fgfr家族，是一種酪氨酸激酶受體。它參與調(diào)控細胞的生長、分化、增殖和轉(zhuǎn)移，對動物早期的胚胎發(fā)育和器官形成具有重要的作用。在哺乳動物中，F(xiàn)gfr1通常由2-3個Ig-like胞外配體結(jié)合域、一個富含絲氨酸的特異酸框、一個轉(zhuǎn)膜域和一個高度保守的酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域，這四個結(jié)構(gòu)域構(gòu)成

3、。Fgfr1通過與其相應(yīng)的配體和HSPG的偶聯(lián)，從而觸發(fā)一系列的信號調(diào)控（如：PKC信號通路、PI3K/PKB信號通路和Ras/ERK信號通路等），對機體的生長發(fā)育等方面產(chǎn)生調(diào)節(jié)。
　　研究一：為對我國主要鳊魴魚類群體進行群體鑒定和遺傳多樣性分析，從60對微衛(wèi)星標(biāo)記中篩選出18對多態(tài)性高的引物，構(gòu)建了6個鳊魴魚類群體的微衛(wèi)星DNA指紋圖譜。結(jié)果顯示，東江三角魴、錢塘江三角魴、厚頜魴、廣東魴、團頭魴和長春鳊6群體的平均等位基因數(shù)（N

4、a）分別為5.17、6.11、3.50、6.56、5.22、5.22，平均期望雜合度(He)分別為0.6342、0.7204、0.5462、0.6812、0.6752、0.5597，平均多態(tài)信息含量（PIC）分別為0.5756、0.6669、0.472、0.6306、0.6064、0.517，表明錢塘江三角魴的遺傳多樣性最高，厚頜魴的遺傳多樣性最低；聚類分析表明，錢塘江三角魴和團頭魴首先聚為一支，遺傳距離較近，為0.5606；厚頜魴與長

5、春鳊的遺傳距離最遠，為1.7592。引物Mam03和EST37產(chǎn)生的特異條帶可將魴屬和鳊屬魚類區(qū)分，鑒定出鳊屬魚類長春鳊；引物TTF3、EST37、TTF2/TTF10、EST66依次組合可區(qū)分出魴屬東江三角魴、厚頜魴和廣東魴這3個群體。研究結(jié)果為我國鳊魴魚類種質(zhì)資源保存、種群鑒定和良種選育奠定了基礎(chǔ)。
　　研究二：采用cDNA末端快速擴增（RACE）的方法克隆了團頭魴fgfr1a和fgfr1b基因，并對團頭魴成魚的多個組織和不同

6、發(fā)育時期的胚胎進行表達分析。另外，通過饑餓實驗和外源生長激素（hGH）處理，對團頭魴幼魚進行了生物學(xué)的表達差異分析。序列分析表明，團頭魴fgfr1a基因cDNA序列全長3572bp，包括702bp的5’端非翻譯區(qū)，413bp的3’端非翻譯區(qū)，2457bp的開放閱讀框（ORF），共編碼818個氨基酸；團頭魴fgfr1b基因cDNA序列全長3117bp，包括469bp的5’端非翻譯區(qū)，398bp的3’端非翻譯區(qū)，2250bp的開放閱讀框（O

7、RF），共編碼749個氨基酸。團頭魴fgfr1a和fgfr1b基因cDNA序列有82％的高相似性。胚胎發(fā)育不同時期，fgfr1a和-1b mRNAs在受精卵時高度表達，然后表達逐漸降低，從16hpf表達趨于穩(wěn)定，但是fgfr1b mRNA在12hpf有強烈表達。整胚原位雜交（WISH）顯示：在16hpf時期，fgfr1a在眼、MHB、腦、前體節(jié)中胚層和尾芽處表達，而fgfr1b僅在眼和前體節(jié)中胚層檢測到表達信號；在28hpf時期，fgf

8、r1a和-1b mRNAs在眼、腦、鰓弓和尾芽處表達；在55hpf時期，fgfr1a和-1b mRNAs又同時在眼、腦、鰓弓和脊索中表達。qRT-PCR表明，在成魚組織中，fgfr1a mRNA在鰓、性腺、腦和中腸中高度表達，在皮膚和腎臟中表達相對較低；而fgfr1b mRNA在腦和肝臟中高度表達，在皮膚、鰓和腎臟中表達相對較低。幼魚的饑餓實驗顯示，饑餓狀態(tài)下fgfr1a和-1b mRNAs在腸和肝臟中的表達明顯上調(diào)，而在心臟中的表達明

9、顯下降。幼魚的hGH處理顯示，hGH會注射隨劑量的差異而不同程度地抑制這兩基因的表達。
　　另外，本文還開展了各品系金魚Tgf2轉(zhuǎn)座子插入拷貝數(shù)和自然缺失狀況的研究。通過Southern blot和常規(guī)PCR技術(shù)對7種金魚品系Tgf2拷貝數(shù)和缺失分布的研究發(fā)現(xiàn)金魚Tgf2轉(zhuǎn)座子在基因組中插入拷貝數(shù)為2-6個不等，且拷貝數(shù)在品系和個體間存在差異。常規(guī)PCR檢測顯示，金魚Tgf2轉(zhuǎn)座子在第1至第2外顯子、第2至第4外顯子區(qū)域存在不同程