家蠶microRNA Novel-31-對(duì)家蠶溶血素基因的表達(dá)的調(diào)控.pdf

1、miRNA（microRNA）是一類內(nèi)源性非編碼小RNA分子，長(zhǎng)度約為20~25個(gè)核苷酸。miRNA通過與靶基因非翻譯區(qū)結(jié)合調(diào)控靶基因的表達(dá)，參與調(diào)控機(jī)體多種生理過程。本實(shí)驗(yàn)室前期研究中在家蠶感染質(zhì)型多角體病毒（BmCPV）72h及96h后對(duì)中腸組織進(jìn)行Solexa測(cè)序，發(fā)現(xiàn)數(shù)個(gè)差異表達(dá)的小RNA，且其中有新發(fā)現(xiàn)的miRNA。本實(shí)驗(yàn)選擇其中一條新發(fā)現(xiàn)的miRNA Novel-31*作為實(shí)驗(yàn)研究對(duì)象，采用生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)其靶基因，通過構(gòu)

2、建miRNA及靶基因慢病毒表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，驗(yàn)證Novel-31*對(duì)靶基因表達(dá)的調(diào)控作用。同時(shí)采用化學(xué)法合成Novel-31* mimics，在家蠶細(xì)胞BmN及蠶體水平驗(yàn)證Novel-31*對(duì)靶基因的表達(dá)調(diào)控作用。得到如下實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　1、家蠶感染BmCPV后Novel-31*及其靶基因表達(dá)發(fā)生變化
　　利用RNAhybrid及NCBI Blast等生物信息學(xué)在線軟件預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)溶血素基因是miRNA Novel-

3、31*的靶基因之一。通過primer5.0設(shè)計(jì)溶血素基因qRT-PCR引物及Novel-31* stem-loop qRT-PCR引物，家蠶感染BmCPV后，不同時(shí)間點(diǎn)取家蠶血淋巴及中腸組織，定量檢測(cè)Novel-31*及溶血素基因表達(dá)變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，家蠶感染BmCPV后，Novel-31*在血淋巴中的表達(dá)量明顯升高，中腸組織中在感染96h后表達(dá)量上調(diào)；家蠶感染BmCPV后，溶血素基因在血淋巴中表達(dá)量明顯升高，在中腸組織中表達(dá)基本無差異。

4、
　　2、Novel-31*對(duì)溶血素基因表達(dá)具有正調(diào)控作用
　?。?）設(shè)計(jì)Novel-31*及溶血素5′UTR引物，擴(kuò)增相應(yīng)序列，分別構(gòu)建表達(dá)Novel-31*和靶基因5′UTR+GST的慢病毒表達(dá)載體pLKO.3G-miR-N31*及pLNHX-UTR-GST。先將重組質(zhì)粒pLNHX-UTR-GST轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，72h后獲得穩(wěn)定表達(dá)5′UTR+GST基因序列的293T細(xì)胞，然后將重組質(zhì)粒pLKO.3G-miR-N31*

5、轉(zhuǎn)染該293T細(xì)胞，24h及48h后收集細(xì)胞，以新霉素基因neo為內(nèi)參，qRT-PCR定量檢測(cè)溶血素基因及GST標(biāo)簽基因的表達(dá)變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Novel-31*能夠上調(diào)GST標(biāo)簽的表達(dá)，說明Novel-31*能夠與溶血素基因5′UTR序列結(jié)合，且正調(diào)控溶血素基因的表達(dá)。
　?。?）為進(jìn)一步驗(yàn)證Novel-31*對(duì)家蠶溶血素基因的調(diào)控作用，采用化學(xué)法人工合成了Novel-31* mimics。將Novel-31* mimics轉(zhuǎn)染家

6、蠶BmN細(xì)胞，檢測(cè)溶血素基因的表達(dá)變化。結(jié)果表明，家蠶BmN細(xì)胞轉(zhuǎn)染Novel-31* mimics24h后，溶血素基因表達(dá)無明顯差異，48h后溶血素基因呈現(xiàn)顯著的上調(diào)表達(dá)，至72小時(shí)該基因仍然呈上調(diào)表達(dá)，但上調(diào)表達(dá)水平有所下降，可能是由于人工合成的mimics發(fā)生降解，NC組與空白對(duì)照組，溶血素基因表達(dá)均無明顯差異。該結(jié)果直接證明了Novel-31*對(duì)溶血素基因的表達(dá)起正調(diào)控作用。
　?。?）采用體腔注射方法，分別將不同濃度No

7、vel-31* mimics注射家蠶體內(nèi)，不同時(shí)間點(diǎn)取家蠶血淋巴及中腸組織，定量檢測(cè)溶血素基因的表達(dá)變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，注射不同濃度Novel-31* mimics，溶血素基因在血淋巴和中腸組織中均明顯上調(diào)表達(dá)，注射DEPC水和Negative control組，溶血素基因表達(dá)量無明顯差異。進(jìn)一步證明溶血素基因是Novel-31*靶基因之一，且Novel-31*正調(diào)控靶基因的表達(dá)。
　　本實(shí)驗(yàn)對(duì) Novel-31*及其靶基因溶血素基因