家蠶卵殼基因鑒定、功能及其表達(dá)調(diào)控研究.pdf

1、昆蟲種類繁多、數(shù)量巨大，是地球生物多樣性的重要貢獻(xiàn)者。在長(zhǎng)期的進(jìn)化過程中，昆蟲與人類形成了復(fù)雜而密切的關(guān)系。一方面，昆蟲為人類提供了大量的物質(zhì)產(chǎn)品，其中鱗翅目昆蟲家蠶也創(chuàng)造了璀璨的蠶絲文化；另一方面，昆蟲也給人類造成了重大的經(jīng)濟(jì)損失，其中直翅目昆蟲蝗蟲更是書寫了一部人類農(nóng)業(yè)社會(huì)的血淚史。昆蟲數(shù)量多種類豐富的主要原因是驚人的產(chǎn)卵能力，大部分昆蟲的產(chǎn)卵量高達(dá)數(shù)百顆。因此，對(duì)昆蟲卵的研究將為有害昆蟲的防治，有益昆蟲產(chǎn)卵量的提高提供重要的理論基

2、礎(chǔ)。
　　卵殼是昆蟲卵細(xì)胞表面復(fù)雜的保護(hù)性結(jié)構(gòu)，主要成分為卵殼蛋白，其編碼基因?yàn)槁褮せ?。本研究以鱗翅目家蠶為研究對(duì)象，關(guān)注了卵殼基因的功能與調(diào)控。首先，鑒定了家蠶卵殼基因并繪制了其時(shí)期表達(dá)模式圖譜，利用LC-MS/MS，分析了卵殼的蛋白質(zhì)組成；其次，在功能研究上，以卵殼基因突變體桂灰卵（Grk）為材料，分析了其可能的突變機(jī)理；最后，在表達(dá)調(diào)控上，以miRNA為研究切入點(diǎn)，重點(diǎn)分析了miRNA在卵殼基因表達(dá)調(diào)控中的角色。本研究獲得

3、的主要研究結(jié)果如下：
　　1.卵殼基因的鑒定及進(jìn)化分析
　　家蠶卵殼基因是一個(gè)超基因家族，所有成員都位于2號(hào)染色體上的一段基因組區(qū)域內(nèi)（卵殼基因位點(diǎn)）。卵殼基因經(jīng)歷了近40年的研究，近百個(gè)卵殼基因被鑒定。然而，高度的重復(fù)序列使卵殼基因位點(diǎn)測(cè)序非常困難，至今未被完整測(cè)序，這嚴(yán)重阻礙了卵殼基因全面、系統(tǒng)的研究。為此，本研究采用了對(duì)BAC測(cè)序的策略獲得了卵殼基因位點(diǎn)全長(zhǎng)序列。首先，分析了家蠶BAC文庫(kù)中卵殼基因位點(diǎn)上200多個(gè)BA

4、C的分布，篩選出7個(gè)能覆蓋完整卵殼基因位點(diǎn)的BAC。通過對(duì)7個(gè)BAC的測(cè)序，拼接組裝得到了871,711bp的卵殼基因位點(diǎn)序列，利用FGENESH軟件對(duì)卵殼基因位點(diǎn)序列進(jìn)行基因預(yù)測(cè)，注釋到127個(gè)卵殼基因和5個(gè)非卵殼基因，其中卵殼基因標(biāo)注為BmCho-1～BmCho-127，包括36個(gè)早期、46個(gè)中期和45個(gè)后期卵殼基因。兩個(gè)卵發(fā)育時(shí)期的cDNA文庫(kù)被用于進(jìn)一步確認(rèn)卵殼基因EST的存在，反向證實(shí)了注釋的卵殼基因。卵殼基因主要以基因?qū)Γ╣

5、ene pair）的形式分布在基因組上。兩個(gè)后期卵殼基因因編碼區(qū)有多個(gè)終止密碼子被成為假基因（pseudogene）。
　　進(jìn)化樹分析結(jié)果顯示同類型的卵殼基因聚成一簇，其中早期B類卵殼基因（early B）在進(jìn)化樹上分為兩個(gè)分支，其中一支和中期B類卵殼基因（middle B）聚到一個(gè)大的分支上。卵殼基因的表達(dá)模式顯示，這個(gè)早期B類卵殼基因分支中的7個(gè)基因有著中期卵殼基因相似的時(shí)期表達(dá)模式。進(jìn)化樹分析也揭示早期卵殼基因經(jīng)歷著較快的進(jìn)

6、化速度，后期卵殼基因在進(jìn)化上相對(duì)保守。兩個(gè)假基因BmCho-23和BmCho-26也經(jīng)歷了較快的進(jìn)化速度。
　　完整卵殼基因位點(diǎn)的鑒定是卵殼基因全面、系統(tǒng)研究的重要基礎(chǔ)，本部分后面的研究都是以此為基礎(chǔ)的。
　　2.卵殼基因的表達(dá)特征分析
　　為了分析卵殼基因在卵發(fā)育過程中的表達(dá)情況，我們構(gòu)建了家蠶卵殼基因的精細(xì)表達(dá)模式圖。首先，我們對(duì)蛹8天不同發(fā)育時(shí)期的卵進(jìn)行了時(shí)期分段，因卵黃生成期（vitellogenesis）無(wú)卵

7、殼基因表達(dá)，此時(shí)期的卵呈微黃色；卵殼生成期（choriogenesis）為卵殼基因次序表達(dá)的時(shí)期，此時(shí)因卵殼的形成使卵色發(fā)白發(fā)亮，這是卵黃與卵殼生成期分段的標(biāo)志。根據(jù)卵殼基因表達(dá)的特征，將卵殼生成期細(xì)分為I～XI的11個(gè)發(fā)育時(shí)期。利用RT-PCR對(duì)鑒定的127個(gè)卵殼基因進(jìn)行了時(shí)期表達(dá)模式圖譜的構(gòu)建，結(jié)果顯示，早期和后期卵殼基因分別在卵殼生成期的早期（I～I(xiàn)II）和后期（IX～XI）表達(dá)，而中期卵殼基因則在整個(gè)卵殼生成期皆有表達(dá)。

8、　　通過對(duì)家蠶cDNA庫(kù)搜索，鑒定到BmCho-1和BmCho-96在精巢中的轉(zhuǎn)錄本。卵泡上皮細(xì)胞和精巢中，BmCho-1的轉(zhuǎn)錄本有著相同的第二外顯子序列，第一外顯子則不同，BmCho-1的精巢轉(zhuǎn)錄本第一外顯子位于卵泡上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)錄本的內(nèi)含子區(qū)域。精巢中BmCho-96的轉(zhuǎn)錄本有三個(gè)外顯子，精巢和卵泡上皮細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄本的編碼區(qū)序列相同，預(yù)測(cè)將編碼相同的蛋白質(zhì)。在家蠶卵胚胎的cDNA文庫(kù)中，鑒定到BmCho-11的轉(zhuǎn)錄本，胚胎中的轉(zhuǎn)錄本編碼區(qū)

9、序列在5’端比卵泡上皮細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄本多27個(gè)堿基，預(yù)測(cè)多編碼9個(gè)氨基酸。
　　分析發(fā)現(xiàn)，幾乎每個(gè)后期卵殼基因除了成熟的轉(zhuǎn)錄本之外，還有一個(gè)拼接中間體形式（splicing intermediate），這種結(jié)構(gòu)包含5’UTR、外顯子、內(nèi)含子、3’UTR和多聚腺嘌呤序列。
　　3.卵殼結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)組分析
　　通過LC-MS/MS質(zhì)譜分析，在大造（P50）卵殼中鑒定到260個(gè)蛋白，包括88個(gè)卵殼蛋白、28個(gè)卵巢特異性蛋白（非

10、卵殼蛋白）和144個(gè)其它類型的蛋白。
　　家蠶卵殼基因主要以基因?qū)Γ╣ene pair）的形式分布在基因組上，每個(gè)基因?qū)Π粋€(gè)A類和一個(gè)B類基因，兩個(gè)基因共用5’側(cè)翼的啟動(dòng)子區(qū)域，A和B基因以相反的方向轉(zhuǎn)錄。在鑒定的卵殼蛋白中，基因?qū)χ蠦編碼的蛋白更容易被鑒定到，這暗示雙向啟動(dòng)子對(duì)B基因可能有更強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄活性。
　　卵殼中也鑒定到的一類卵巢特異的蛋白，編碼這類蛋白的基因主要成簇地分布在2號(hào)、10號(hào)、15號(hào)和16號(hào)染色體上，但

11、多數(shù)為功能未知的家蠶特異基因。在2號(hào)染色體的卵殼基因位點(diǎn)上游100 kb的范圍內(nèi)分布著12個(gè)卵巢特異基因，其中的10個(gè)基因編碼的蛋白在卵殼中被鑒定到，雖然它們的功能未知，但推測(cè)它們?cè)诼褮せ虻谋磉_(dá)或卵殼結(jié)構(gòu)形態(tài)構(gòu)建中扮演著重要的作用。
　　4.家蠶桂灰卵（Grk）突變機(jī)理初探
　　桂灰卵（Grk）是家蠶卵殼基因突變導(dǎo)致的灰色卵突變體，突變基因位于卵殼基因位點(diǎn)內(nèi)（2-7.2）。表現(xiàn)型為：同質(zhì)型（Grk/Grk）卵為球形，受精率

12、低；異質(zhì)型（Grk/+）卵形正常，卵色為灰色，受精率正常；正常型（+/+）卵色為深褐色。
　　SEM觀察顯示，Grk三種基因型卵殼表面沒有明顯的差異，而它們的卵殼層和卵孔處有較大差異。在卵殼層上，Grk正常型的卵殼層由平行于卵細(xì)胞的片層構(gòu)成；而雜合型卵殼中間層的片層呈現(xiàn)垂直于卵細(xì)胞表面的表型；純合型卵殼中間片層則出現(xiàn)了更大程度的破壞，幾乎呈現(xiàn)紊亂的狀態(tài)。在卵孔結(jié)構(gòu)上，Grk正常型卵孔被花瓣?duì)畎呒y圍繞，內(nèi)層的斑紋凸出卵殼表面，卵孔出

13、有4個(gè)卵孔管口。雜合型卵孔周圍的花瓣?duì)畎呒y明顯比正常型小，且內(nèi)層的斑紋凸出程度減小，卵孔管口個(gè)數(shù)正常；純合型卵孔處的斑紋同樣變小，內(nèi)層的斑紋幾乎無(wú)凸出的表型，卵孔管口僅為2個(gè)。Grk正常型、雜合型和純合型卵孔內(nèi)層斑紋的花瓣數(shù)依次減少。通過對(duì)Grk卵殼的觀察，我們可以推斷Grk突變體在卵殼殼層結(jié)構(gòu)發(fā)生的較大變化是導(dǎo)致其呈現(xiàn)灰色卵表型的基礎(chǔ)，卵孔管口的減少則是卵受精率大大降低的原因。
　　對(duì)卵殼結(jié)構(gòu)蛋白提取時(shí)發(fā)現(xiàn)Grk正常型、雜合型及

14、純合型卵殼結(jié)構(gòu)在8 M尿素/35mM DTT裂解液中溶解度依次降低，在此裂解液基礎(chǔ)上增加DTT濃度，將增加Grk突變體溶解度，但不能完全溶解。如果增加1%的SDS，則能完全溶解Grk突變體卵殼。這表明Grk突變體卵殼結(jié)構(gòu)的變化可能影響了卵殼蛋白的溶解。
　　Grk三種基因型卵殼的定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析顯示，BmCho-20、BmCho-41、BmCho-57、BmCho-62、BmCho-73和BmCho-115在Grk正常型、雜合型

15、和純合型卵殼中的含量呈依次增加，其中BmCho-20和BmCho-115為早期卵殼蛋白，BmCho-73為中期卵殼蛋白，BmCho-41、BmCho-57和BmCho-62為后期卵殼蛋白。富含半胱氨酸的后期卵殼蛋白主要分布在卵殼外層，其豐富的二硫健使卵殼形成堅(jiān)硬的外層結(jié)構(gòu)，因此，3個(gè)后期卵殼蛋白的上調(diào)增加了Grk突變體卵殼的硬度，使其更難溶解。同時(shí)，卵殼基因具有嚴(yán)格的時(shí)期特異性，如果Grk通過延長(zhǎng)表達(dá)時(shí)間來(lái)上調(diào)卵殼蛋白，則將會(huì)擾亂卵殼形

16、態(tài)構(gòu)建的進(jìn)程，造成卵殼結(jié)構(gòu)的改變。另一方面，BmCho-17在正常型和雜合型卵殼中有表達(dá)，但在純合型中丟失，且BmCho-17是中期卵殼蛋白，應(yīng)該在卵殼中層構(gòu)建中起作用。因此它在Grk純合型卵殼中的丟失勢(shì)必影響到中層卵殼的形態(tài)構(gòu)建。
　　5.miRNA對(duì)卵殼基因表達(dá)調(diào)控分析
　　卵殼基因表達(dá)有著嚴(yán)格的組織和時(shí)期特異性，其表達(dá)調(diào)控研究是最早的模式基因之一。但已報(bào)道的調(diào)控因子仍不能完全清楚地解釋數(shù)量龐大的卵殼基因的調(diào)控機(jī)制。為此

17、，本研究分析了miRNA在卵殼基因表達(dá)調(diào)控中的角色，通過高通量測(cè)序，在家蠶蛹8天卵殼生成期的卵泡上皮細(xì)胞中鑒定到847個(gè)miRNA，其中包括399個(gè)已知miRNA和448個(gè)新鑒定的miRNA。qPCR結(jié)果顯示，33個(gè)miRNA在卵泡上皮細(xì)胞特異表達(dá)。靶基因預(yù)測(cè)顯示miRNA潛在的調(diào)控了所有類型的卵殼基因及其轉(zhuǎn)錄因子，分析也發(fā)現(xiàn)，在miRNA對(duì)卵殼基因的調(diào)控中，存在著一個(gè)miRNA基于相同的靶位點(diǎn)序列調(diào)控一類卵殼基因的模式。miRNA與卵