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文檔簡介
1、SOST基因(sclerostin,SOST)位于人類基因組的17q12-21,主要在骨細胞中表達,含有兩個外顯子和一個內(nèi)含子,編碼硬化蛋白。硬化蛋白是一種糖蛋白,是骨形成的一個負調(diào)節(jié)者,SOST基因敲除的小鼠骨密度顯著增加。SOST基因突變引起以骨密度增加為特征的硬縮癥Van Buchem和鞏膜固化(Sclerosteosis),Dutch VanBuchem則是SOST基因下游35kb處一個52kb的缺失引起的。
我們
2、先前發(fā)現(xiàn)SOST基因-9247的順式調(diào)節(jié)多態(tài)性T/C(rs1230399)與骨密度顯著關(guān)聯(lián)。計算分析表明rs1230399位于兩個協(xié)同轉(zhuǎn)錄因子FOXA1和C/EBPα的中心識別區(qū)域。T/C多態(tài)影響FOXA1和C/EBPα與SOST基因DNA序列的結(jié)合,這個生物信息學的分析結(jié)果需要用實驗的方法加以證明。
研究DNA與蛋白質(zhì)互作的方法主要有凝膠電泳遷移率實驗(Electrophoreticmobility shift assa
3、y,EMSA)、染色質(zhì)免疫共沉淀(Chromatin Immunoprecipitation,CHIP)實驗和反轉(zhuǎn)錄PCR(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)等實驗方法。本研究的目的就是通過EMSA、CHIP實驗證明SNP位點rs1230399 T/C多態(tài)對SOST基因表達和轉(zhuǎn)錄因子FOXA1結(jié)合的影響。本研究結(jié)果將對全面理解rs1230399T/C多態(tài)的功能和
4、SOST基因的表達調(diào)控有重要意義,也為揭示骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病機理提供一定的理論依據(jù)。
人骨肉瘤SAOS-2細胞是研究SOST基因表達的一個比較好的細胞系,本研究以SAOS-2細胞為材料,先以Western Blot方法確定該細胞中有FOXA1蛋白的表達,再分別通過細胞外實驗EMSA和細胞內(nèi)實驗CHIP兩個方法來研究rs1230399 T/C多態(tài)對SOST基因表達和轉(zhuǎn)錄因子FOXA1結(jié)合的影響。
通過多次實驗,E
5、MSA結(jié)果顯示我們所設計的含有T/C的探針所結(jié)合的蛋白不是我們預期的FOXA1蛋白,T/C與轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合都沒有明顯差異,在進一步用CHIP實驗重復時也沒有得到與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的DNA序列片段。
通過RT-PCR方法研究SOST基因的本底表達,經(jīng)過多次引物設計摸索中擴增出了SOST基因,實驗結(jié)果表明SOST基因在SAOS-2細胞中表達量偏低。用10μM和1μM雌激素處理24h后,SOST基因和FOXA1基因轉(zhuǎn)錄水平的表達量都
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