人工核酶核糖開關調控轉基因表達的性能及優(yōu)化.pdf

1、轉基因的表達調控，在基因治療中起著舉足輕重的作用。隨著對RNA功能研究的日益深入，越來越多的研究者在選擇調控工具時，將目光轉向非編碼RNA（noncoding RNA，ncRNA）。尤其是小的人工合成的ncRNA，工作效率高、免疫原性低，可以作為理想的基因治療調控工具。而核糖開關（riboswitch）的發(fā)現(xiàn)，又為ncRNA在基因表達調控中的研究和應用翻開了新篇章。
　　核糖開關由適體和表達平臺兩部分序列構成。適體域與其相應配體的

2、結合可引起整個核糖開關二級結構的變化，從而控制轉基因的表達。配體的結合可引起轉基因表達量上升的核糖開關為ON型開關，反之為OFF型開關。人工構建的核糖開關，即根據(jù)其自然構成方式進行設計。核酶型核糖開關（或核酶核糖開關，簡稱核酶開關），使用核酶作為表達平臺，通過調控核酶自身剪切的能力來控制轉基因的表達。因其結構和作用機制都較為簡單，成為目前研究的熱點。
　　本文介紹的HTRS-1（Hammerhead Theophylline Ri

3、boswitch1）型核酶開關，通過人工合理設計，由茶堿適體和煙草環(huán)斑病毒錘頭狀核酶構成，屬于ON型核糖開關。可使用重組質粒載體或重組腺相關病毒（recombinant adeno-associ-ated virus，rAAV）進行，在哺乳動物細胞中發(fā)揮作用。實驗證明：HTRS-1核酶開關能夠針對多種轉基因、在多種哺乳動物細胞中發(fā)揮調控轉基因表達的作用，但調控能力會因轉基因或宿主細胞種類的不同而有所改變，單個HTRS-1核酶開關對轉基因

4、表達的調控倍數(shù)約在1.7~3.7倍不等。
　　針對核酶開關調控轉基因表達時存在的不足（如基礎表達量低，調控范圍（調控倍數(shù)）窄等），本文對HTRS-1核酶開關的結構進行了改造，包括：其催化核心環(huán)上的選擇性起始密碼子的突變消除；HTRS-1核酶開關在轉基因 UTR插入位置的篩選；多個HTRS-1核酶開關的串聯(lián)等。結果顯示：采用不同方式改造的核酶開關，調控轉基因表達的效果不同。最終得到動力學性能最好的核酶開關，是同時在轉基因序列兩端UT