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文檔簡介
1、稻米是人類的主食,其中的貯藏蛋白易被消化吸收,但蛋白質(zhì)含量較低,賴氨酸含量也缺乏,是稻米蛋白質(zhì)中的第一限制必需氨基酸。所以,提高稻米中的必需氨基酸含量和蛋白質(zhì)含量,平衡其營養(yǎng)品質(zhì),一直是遺傳育種學家追求的目標之一。常規(guī)育種技術己在鑒別突變體以改良主要糧食作物蛋白質(zhì)營養(yǎng)品質(zhì)等方面獲得了一些進展,但在水稻中卻收效甚微。分子生物技術的發(fā)展為改良稻米種子蛋白質(zhì)營養(yǎng)品質(zhì)提供了一條有效的技術路線。本研究即是要通過基因工程技術,在水稻種子胚乳中過表達
2、水稻內(nèi)源谷蛋白以及來自異源植物四棱豆的一個富含賴氨酸的蛋白質(zhì)(Lysine-rich protein,LRP),以提高稻米中的谷蛋白組成以及賴氨酸含量,最終達到改良稻米營養(yǎng)品質(zhì)的目的。為此,重點開展了兩個方-面的研究工作,包括:(1)水稻貯藏蛋白基因的過表達以及對水稻蛋白含量的影響。(2)高賴氨酸含量轉(zhuǎn)基因水稻新品系HL1與HL5的表達分析與分子特征分析。主要研究結(jié)果如下:
第一,為了能用種子胚乳特異性表達的啟動子來指導目
3、標蛋白在轉(zhuǎn)基因水稻種子中高效特異地表達,本研究利用谷蛋白基因Gtl(GluA-2)和醇溶蛋白基因RP5的啟動子連同水稻谷蛋白Gt1(GtuA-2)基因構建成嵌合基因,并導入9983與武育粳3號兩個水稻品種中。對轉(zhuǎn)基因水稻中mRNA的表達以及總蛋白含量分析表明:(1)所有啟動子都能指導Gt1基因在轉(zhuǎn)基因水稻種子的胚乳中轉(zhuǎn)錄,但最終種子總蛋白含量卻無明顯變化,說明通過增加谷蛋白基因的辦法不能提高稻米蛋白的含量;(2)在將Gt1 N-端信號肽
4、編碼序列或?qū)⑵涮鎿Q成醇溶蛋白N-端信號肽編碼序列后,由RP5啟動子引導的Gt1融合基因有明顯的轉(zhuǎn)錄活性,但最終未能篩選到高谷蛋白或低醇溶蛋白轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)化事件,信號肽的作用不明顯。(3)為借助于農(nóng)桿菌介導的雙元載體轉(zhuǎn)化方法培育可剔除抗性選擇標記轉(zhuǎn)基因水稻,構建了含雙T-DNA區(qū)的超雙元載體,證明用超雙元載體法可將外源基因與抗性選擇標記基因同時導入并整合到同一個水稻細胞的基因組中;在由超雙元載體法轉(zhuǎn)化獲得的轉(zhuǎn)基因水稻植株的自交后代中,已篩選獲
5、得了無抗性選擇標記基因但含Gt1基因的轉(zhuǎn)基因水稻轉(zhuǎn)化事件。
第二,本實驗室在前期研究中用Gt1基因的啟動子及其5'調(diào)控序列與LRP cDNA構建了一個嵌合基因,又采用融合蛋白策略,即將富含賴氨酸的LRP融合進水稻谷蛋白Gt1的堿性亞基中,設計并構建了1個Gt1∶∶LRP融合蛋白。將這兩種構建都導入了同一個水稻品種9983中,通過篩選,分別獲得了兩個不含有抗性選擇標記、高賴氨酸含量轉(zhuǎn)基因水稻新品系HL1與HL5。本研究主要對
6、這兩個新品系進行表達與分子特征分析,主要結(jié)論如下:(1)在Gt1基因啟動子的指導下,LRP與Gt1∶∶LRP融合蛋白都能在轉(zhuǎn)基因水稻種子中高效表達并穩(wěn)定積累;(3)Gg1∶∶LRP融合蛋白能在轉(zhuǎn)基因水稻種子中正常翻譯,產(chǎn)生預期分子量大小的融合蛋白;當LRP融合進谷蛋白的堿性亞基時,只形成單一分子量的融合蛋白,未發(fā)生翻譯后加工等過程。(4)轉(zhuǎn)化事件HL1與HL5都是雙拷貝單插入位點;(5)轉(zhuǎn)化事件HL1的兩個。T-DNA區(qū)為頭尾相連,插入
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