水稻OsRhoGDI2基因表達(dá)調(diào)控的研究.pdf

1、水稻育性基因的挖掘是遺傳育種工作者關(guān)注的重要問題之一。已有研究顯示，水稻Rho基因OsRacD與水稻生殖發(fā)育有關(guān)。實(shí)驗(yàn)室前期，已對(duì)OsRacD及其相互作用蛋白開展了系統(tǒng)的研究，證明了水稻RhoGDP解離抑制因子OsRhoGDI2是OsRacD的相互作用蛋白，并且二者的表達(dá)存在協(xié)同性，提示OsRhoGDI2和OsRacD可能在水稻生長(zhǎng)發(fā)育過程中存在重要的功能聯(lián)系。本研究以O(shè)sRhoGDI2基因啟動(dòng)子功能鑒定為切入點(diǎn)，旨在研究該基因的表達(dá)調(diào)

2、控特征，確定影響該基因表達(dá)的激素和非生物脅迫因素，并對(duì)實(shí)驗(yàn)室前期獲得的該基因的RNAi水稻T1代進(jìn)行篩選，為深入研究該基因在水稻生長(zhǎng)發(fā)育和育性控制中的功能奠定基礎(chǔ)。
　　采用qRT-PCR技術(shù)分析了IAA、6-BA、GA、MeJ-A、ABA、SA六種激素，以及干旱、高鹽兩種非生物脅迫對(duì)OsRhoGDI2基因在水稻幼苗期地上部分表達(dá)的影響。結(jié)果顯示，水稻OsRhoGDI2基因在激素IAA、ABA、MeJ-A、6-BA、SA處理時(shí)，表

3、達(dá)量都高于處理之前，分別在在24h、8h、4h、8h、4h表達(dá)量達(dá)到最大，上調(diào)了約5倍、9倍、7倍、5倍、9倍。而GA則抑制OsRhoGDI2基因的表達(dá)，在8h時(shí)降至處理前的30％。在干旱和高鹽脅迫下，OsRhoGDI2的表達(dá)量也成倍的提升，分別在8h和12h時(shí)表達(dá)量達(dá)到最大，分別上調(diào)了約7倍和18倍。上述結(jié)果說明IAA、6-BA、Me-JA、ABA、SA以及干旱、高鹽可以誘導(dǎo)OsRhoGDI2基因的表達(dá)，但是GA抑制其表達(dá)。
　

4、　采用PCR技術(shù)克隆了該基因長(zhǎng)度為2266bp的啟動(dòng)子，并采用生物信息學(xué)方法對(duì)OsRhoGDI2基因啟動(dòng)子進(jìn)行了順式作用元件的預(yù)測(cè)和分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，除了真核基因基本的順式作用元件外，其啟動(dòng)區(qū)上還分布著多個(gè)激素應(yīng)答和逆境相關(guān)的順式作用元件，包括ABA應(yīng)答元件、GA應(yīng)答元件、IAA應(yīng)答元件、MeJ-A應(yīng)答元件、植物光應(yīng)答元件和傷應(yīng)答元件等。這與上述qRT-PCR結(jié)果可以部分相互印證。
　　采用DNA重組技術(shù)，構(gòu)建了OsRhoGDI2基

5、因啟動(dòng)子與GUS融合的植物表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化水稻，篩選轉(zhuǎn)基因植株。通過對(duì)轉(zhuǎn)基因水稻進(jìn)行激素和非生物脅迫處理，利用qRT-PCR檢測(cè)了GUS報(bào)告基因在水稻幼苗地上部分的表達(dá)模式。結(jié)果顯示，GUS基因在ABA、MeJ-A、IAA的處理下，表達(dá)量都會(huì)上調(diào)，最大值分別出現(xiàn)在8h、4h、24h，且表達(dá)量分別上調(diào)了約6倍、8倍、16倍。在6-BA、和SA的處理下該基因表達(dá)變化不明顯。而在GA的處理下出現(xiàn)了被抑制的現(xiàn)象，且在8h時(shí)抑制程度最大，與對(duì)照相比

6、，表達(dá)量不足20％。說明本研究選擇的OsRhoGDI2基因啟動(dòng)子中包含了ABA、 GA、MeJ-A、IAA、干旱和鹽脅迫的應(yīng)答元件，但可能沒有包含應(yīng)答6-BA、SA的關(guān)鍵元件。
　　在水稻揚(yáng)花期以后，對(duì)轉(zhuǎn)基因水稻的根、莖、葉、花粉、穎殼、種子進(jìn)行GUS組織化學(xué)染色分析，鑒定OsRhoGDI2基因表達(dá)的細(xì)胞學(xué)特征，結(jié)果顯示，所有植株中的葉鞘、葉柄和花粉，呈現(xiàn)出較強(qiáng)的顏色反應(yīng)，而在葉片、穎殼、頸節(jié)等處沒有表達(dá)。通過徒手切片和顯微觀察進(jìn)