水稻全生育期基因表達譜構(gòu)建與側(cè)生分枝發(fā)育的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)研究.pdf

1、植物的生長發(fā)育過程受到基因表達方式的嚴(yán)格調(diào)控。剖析基因表達模式，不僅可以解釋植物生長發(fā)育的機制，而且可以用于指導(dǎo)農(nóng)作物的遺傳改良。水稻作為世界上最主要的糧食作物之一，同時也是單子葉植物研究的模式物種，對其進行基因轉(zhuǎn)錄組的研究，既有利于理解植物發(fā)育的調(diào)控機制，也可以為其它多種作物的研究提供幫助。植物株型很大程度上由側(cè)生分枝的發(fā)育決定的。水稻中側(cè)生分枝包含營養(yǎng)生長時期的分蘗和生殖生長時期的穗分枝，這兩種分枝深刻的影響水稻的產(chǎn)量，因此是水稻遺

2、傳改良的重要目標(biāo)性狀。本研究通過構(gòu)建覆蓋39個器官的轉(zhuǎn)錄組，建立了覆蓋水稻全生育期的表達譜，并且和擬南芥的轉(zhuǎn)錄組進行了比較研究，發(fā)現(xiàn)了大量的與穗分枝發(fā)育有關(guān)的基因。通過對這些基因的功能研究，發(fā)現(xiàn)了一個主要由小RNA和轉(zhuǎn)錄因子組成的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)協(xié)同調(diào)控了水稻側(cè)生分枝的發(fā)育。
　　本研究主要內(nèi)容包括：⑴利用Affymetrix GeneChip Rice Genome Array對兩個秈稻品種珍汕97和明恢63進行轉(zhuǎn)錄組分析，構(gòu)建了覆

3、蓋全生育39個組織的基因表達譜，并且通過多種方式驗證了數(shù)據(jù)的質(zhì)量。這些數(shù)據(jù)建立了一個新的水稻功能基因組研究的平臺。⑵通過表達譜分析了各個組織在發(fā)育上的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)基因表達模式和器官發(fā)育的同源性之間有很好的對應(yīng)關(guān)系。雄蕊跟別的器官具有截然不同的基因表達模式，而愈傷和根細(xì)胞之間具有發(fā)育上的相關(guān)性。⑶通過比較處于連續(xù)4個發(fā)育階段的幼穗的轉(zhuǎn)錄組，發(fā)現(xiàn)了2667個基因存在差異表達。同時發(fā)現(xiàn)有兩組基因從幼穗發(fā)育早期到后期，表現(xiàn)出相反的表達模式。第一組

4、基因從早期到后期幼穗中，逐漸下調(diào)表達，其中包含了多個已經(jīng)克隆的控制穗型態(tài)發(fā)育的基因，暗示這組基因可能與穗部枝梗發(fā)育有關(guān)。3個受到miR156調(diào)控的SPL基因也出現(xiàn)在第一組基因中。而第二組基因則從早期到后期的幼穗中逐漸上調(diào)表達，其中包含有多個與花器官發(fā)育有關(guān)的MADS基因。對兩組基因進行GO分析發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子都被富集了，說明轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié)在穗型態(tài)發(fā)育過程中有著重要的作用。⑷分別鑒定到2376個組織特異表達和7276個組成型表達基因，并且發(fā)現(xiàn)

5、19個不受遺傳背景、生長環(huán)境、外界刺激等影響的最穩(wěn)定表達的基因。⑸通過表達譜的相似性，建立了水稻和擬南芥器官之間發(fā)育的對應(yīng)關(guān)系，并且發(fā)現(xiàn)11對雙向最匹配的器官。在這些器官中，兩個物種的直系同源基因表達豐度是保守的，但是超過一半的基因發(fā)生了表達模式的分化，說明很多直系同源基因在兩個物種中可能發(fā)生了功能分化。⑹比較了水稻和擬南芥組織特異表達基因和組成型表達基因，發(fā)現(xiàn)具有組織特異表達特點的基因往往也是物種特異的，而組成型表達基因則有大量的保守

6、基因，并且組織表達特異的直系同源基因具有更快的進化速度。⑺超量表達miR156導(dǎo)致分蘗極大增多，但是穗部分枝被嚴(yán)重抑制;而抑制miR156則得到了和超量表達相反的表型，說明miR156正調(diào)控分蘗發(fā)育，但是負(fù)調(diào)控花序分生組織活性。因為被miR156調(diào)控的SPL7，SPL14和SPL17都從幼穗發(fā)育的早期到后期逐漸下調(diào)表達，因此推測這三個SPL基因可能調(diào)控了水稻的側(cè)枝發(fā)育。⑻水稻中miR529與miR156共同調(diào)控SPL基因，超量表達miR

7、529得到了和超量表達miR156相似的表型。⑼SPL7單突變不影響水稻的株型;而抑制SPL14或者SPL17則可以得到和超量表達miR156或者miR529類似的表型，分蘗增加，穗部枝梗減少，說明SPL基因抑制分蘗發(fā)育，但是促進花序分生組織活性。SPL14和SPL17雙RNAi的材料增強了表型變化，說明SPL基因可能是冗余控制水稻發(fā)育的。超量表達SPL7，SPL14和SPL17都導(dǎo)致分蘗的減少，但是穗部枝梗也減少，特別是每個一次枝梗上

8、分化的二次枝梗數(shù)量，表明SPL還促進小穗分生組織的分化。超量表達SPL基因可以部分恢復(fù)miR156超量表達的表型。⑽超量表達miR172不影響分蘗發(fā)育，但是導(dǎo)致穗部一次枝梗減少，并且每個一次枝梗上分化的二次枝梗也減少;而抑制miR172的表達也不影響分蘗發(fā)育，但是導(dǎo)致一次和二次枝梗都增加，說明miR172負(fù)調(diào)控花序分生組織活性，但是促進小穗分生組織的分化。抑制miR172的靶基因AP2類的SNB和OsTOE1得到了類似miR172的表型

9、變化;而超量表達SNB和OsTOEI則和抑制miR172的表型類似，說明miR172對穗型的調(diào)控作用是通過靶基因?qū)崿F(xiàn)的。⑾植物體內(nèi)實驗證明AP2類基因編碼轉(zhuǎn)錄抑制子，并且包含有轉(zhuǎn)錄抑制模體EAR結(jié)構(gòu)。體內(nèi)體外實驗證明AP2類蛋白質(zhì)可以和轉(zhuǎn)錄共抑制子ASP1互作，并且分別是AP2的EAR結(jié)構(gòu)和ASP1的CTLH結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)了這種互作。遺傳分析結(jié)果證明了ASP1對AP2類基因調(diào)控穗分枝發(fā)育是必需的。⑿基因表達分析表明miR156和miR172

10、具有互補的表達模式，并且在SPL超量表達材料中，miR172及其前體基因pri-miR172b和pri-miR172d上調(diào)表達。利用ChIP，酵母單雜交和EMSA證明了SPL14可以直接調(diào)控miR172的表達。遺傳學(xué)分析進一步證明了SPL基因是通過miR172促進小穗分化的。⒀PAP2/MADS34也通過抑制RCN基因促進小穗分化?；虮磉_分析表明SPL基因正調(diào)控PAP2/MADS34的表達，并且ChIP和EMSA證明SPL14可以直接

11、調(diào)控PAP2/MADS34的表達，表明SPL基因也可可能通過PAP2/MADS34-RCN的途徑促進小穗的分化。遺傳分析證明RCN1可以恢復(fù)SPL基因超量表達導(dǎo)致的小穗分化的異常。⒁通過比較miR156超量表達植株和野生型的幼穗，發(fā)現(xiàn)了大量的基因發(fā)生了差異表達，包括很多已知的控制穗型發(fā)育的基因，如LAX1和RFL，并且這些基因同SPL基因共表達，說明SPL基因也可能通過這些基因調(diào)控穗分枝。遺傳學(xué)分析證明了LAX1和RFL對SPL基因的功