水稻根系發(fā)育調(diào)控基因OSGLU3的克隆與功能研究.pdf

1、通過篩選EMS誘變的水稻（shishoubaimao，SSBM）突變體庫，獲得一個(gè)短根突變體（ssbm short root，Osssr-1），其伸長區(qū)縮小，成熟區(qū)細(xì)胞長度是野生型的1/3。
　　 圖位克隆結(jié)果表明：該突變基因位于第四號(hào)染色體短臂上，在基因(LOC_04941970)基因組的第2947個(gè)堿基處發(fā)生了T到A的點(diǎn)突變，導(dǎo)致蛋白序列上第451個(gè)脂肪族類亮氨酸(Leu)突變?yōu)閴A性氨基酸類組氨酸(His）。該基因在網(wǎng)站CA

2、ZY上(http://www.cazy.org/GH9_eukaryota.html)被命名為OsGLU3,是一個(gè)假定的β-1，4-葡聚糖內(nèi)切酶，該類酶水解纖維素內(nèi)的β-1，4-糖苷鍵。轉(zhuǎn)基因回復(fù)實(shí)驗(yàn)及該基因的T-DNA插入突變體Osglu3-2進(jìn)一步證明Osssr-1突變表型是由于OsGLU3突變?cè)斐傻摹?br>　　 觀察可以回復(fù)突變體表型的proOsGLU3::OsGLU3::GUS轉(zhuǎn)基因植株，發(fā)現(xiàn)該基因在根、側(cè)根、葉、不定根原基

3、及穎殼的穎毛上表達(dá)，特別是在根的伸長區(qū)和成熟區(qū)、側(cè)根根尖，不定根原基的根冠表達(dá)強(qiáng)烈。
　　 利用可以回復(fù)突變體表型proOsGLU3::OsGLU3::sGFP轉(zhuǎn)基因植株，觀察蛋白OsGLU3的亞細(xì)胞定位，發(fā)現(xiàn)該基因在亞細(xì)胞中的定位是發(fā)育依賴的，在分生區(qū)及伸長區(qū)分布于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)小體及質(zhì)膜上分布，在成熟區(qū)定位于質(zhì)膜上。當(dāng)FM4-64(細(xì)胞內(nèi)吞途徑指示劑)處理該轉(zhuǎn)基因植株后，OsGLU3-GFP與FM4-64部分共定位，說明OsGLU

4、3參與了細(xì)胞內(nèi)吞途徑。BFA（囊泡運(yùn)輸抑制劑）處理后，OsGLU3-GFP與FM4-64完全共定位，說明OsGLU3也在高爾基體上定位，很可能是通過囊泡運(yùn)輸運(yùn)輸?shù)馁|(zhì)膜行使功能。
　　 突變體Osglu3也是一個(gè)溫度敏感的突變體，在26℃根長接近野生型，340℃恒溫下突變表型加劇。而T-DNA插入突變體Osglu3-2沒有表現(xiàn)出對(duì)溫度的敏感性，說明OsGLU3在Leu451上的點(diǎn)突變導(dǎo)致蛋白對(duì)溫度敏感。
　　 CYCB1，

5、1：GUS(分生區(qū)報(bào)告基因)在突變體中的表達(dá)區(qū)域縮小，說明OsGLU3參與了根分生區(qū)的調(diào)控。
　　 施加3％外源的葡萄糖、纖維二糖完全回復(fù)突變體表型，施加外源3％的蔗糖、果糖顯著回復(fù)突變體Osglu3表型，3％外源葡萄糖也可以部分回復(fù)T-DNA插入突變體Osglu3-2的根系長度，說明外源糖回復(fù)突變體表型是有其他基因的參與。
　　 突變體Osglu3根內(nèi)的葡萄糖含量與野生型沒有明顯差異，根細(xì)胞壁中纖維素含量明顯低于野生型

6、，而地上部中沒有降低，說明OsGLU3在水稻根系纖維素合成有著重要作用。
　　 缺磷條件可以部分回復(fù)突變體表型，根伸長區(qū)縮短表型消失，CYCYB1,1:GUS標(biāo)記的分生區(qū)擴(kuò)大，成熟區(qū)細(xì)胞長度部分回復(fù);缺氮卻加劇突變體根伸長區(qū)縮小表型;定量PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)野生型中磷饑餓下表達(dá)沒有被誘導(dǎo)，復(fù)饑餓條件下被誘導(dǎo)表達(dá)，在突變體中則恰好相反。氮磷饑餓不能回復(fù)T-DNA插入突變體的表型，說明OsGLU3在氮磷饑餓誘導(dǎo)根系伸長途徑中有重要的作用，