應(yīng)用轉(zhuǎn)基因技術(shù)提高稻谷耐貯藏特性的研究.pdf

1、該研究利用基因工程新近研究進(jìn)展,分別采用反義RNA及RNA干涉技術(shù)在水稻胚乳中特異沉默內(nèi)源lox基因,以期提高稻谷自身的耐貯藏遺傳特性.另外,基于對轉(zhuǎn)基因安全的考慮,特別是該試驗(yàn)的目的器官是作為糧食的水稻胚乳,作者從Syngenta公司引進(jìn)了甘露糖選擇標(biāo)記基因,以期能初步建立水稻遺傳轉(zhuǎn)化的甘露糖選擇標(biāo)記系統(tǒng),為今后能在水稻轉(zhuǎn)基因研究中利用這一安全的選擇標(biāo)記系統(tǒng)打下基礎(chǔ).主要研究結(jié)果如下:1)構(gòu)建了三個(gè)用于轉(zhuǎn)化的雙元表達(dá)載體:A:p13W

2、4H,含胚乳特異表達(dá)啟動子、lox cDNA發(fā)夾結(jié)構(gòu)及潮霉素選擇標(biāo)記基因hpt;B:p13W8AP,含胚乳特異表達(dá)啟動子、lox cDNA反義結(jié)構(gòu)及甘露糖選擇標(biāo)記基因manA;C:p13W8HP,含胚乳特異表達(dá)啟動子、lox cDNA發(fā)夾結(jié)構(gòu)及甘露糖選擇標(biāo)記基因manA.2)以農(nóng)桿菌介導(dǎo)用表達(dá)載體p13W4H對粳稻品種石狩白毛(Ishikari-shiroge)和T162進(jìn)行了轉(zhuǎn)化,分別獲得158個(gè)和56個(gè)獨(dú)立轉(zhuǎn)化株系.經(jīng)PCR檢測,石

3、狩白毛轉(zhuǎn)基因植株的PCR陽性率為94.3﹪(149/158),T162轉(zhuǎn)基因植株的PCR陽性率為98.2﹪(55/56).Southern檢測結(jié)果表明,外源DNA片段已完整整合到水稻基因組中,多數(shù)為單拷貝插入,拷貝數(shù)最多的有4個(gè).對部分T1代種子進(jìn)行了潮霉素抗性遺傳分析,證明外源基因在轉(zhuǎn)基因后代中發(fā)生了分離.3)以幼胚為轉(zhuǎn)化受體,農(nóng)桿菌介導(dǎo)分別用p13W8AP和p13W8HP對粳稻品種石狩白毛進(jìn)行了轉(zhuǎn)化,經(jīng)過在含不同甘露糖和蔗糖濃度組合

4、的培養(yǎng)基上篩選,分別獲得13個(gè)和27個(gè)獨(dú)立轉(zhuǎn)化株系.該研究初步建立了水稻遺傳轉(zhuǎn)化的甘露糖選擇標(biāo)記系統(tǒng).文中還對該體系的各種影響因素及存在的問題分別進(jìn)行了分析討論.4)分別對轉(zhuǎn)p13W4H的9個(gè)、轉(zhuǎn)p13W8AP的2個(gè)和轉(zhuǎn)p13W8HP的4個(gè)株系的T1代種子進(jìn)行了人工陳化以及LOX酶活測定,并將它們分別與潮霉素或甘露糖抗性遺傳分析結(jié)果以及Southern雜交結(jié)果進(jìn)行了對比.文中還對lox cDNA不同結(jié)構(gòu)及其拷貝數(shù)對水稻內(nèi)源基因的沉默或阻