環(huán)形泰勒蟲(chóng)TαSDP基因的表達(dá)與功能的初步研究.pdf

1、環(huán)形泰勒蟲(chóng)是一種蜱傳血液原蟲(chóng)，能引起牛的熱帶泰勒蟲(chóng)病。環(huán)形泰勒蟲(chóng)和小泰勒蟲(chóng)裂殖體感染的牛淋巴細(xì)胞在體外表現(xiàn)具有無(wú)限增值（永生化）的能力，即其具有轉(zhuǎn)化宿主淋巴細(xì)胞的特性，因此被稱(chēng)為可轉(zhuǎn)化淋巴細(xì)胞泰勒蟲(chóng)。泰勒屬的寄生蟲(chóng)是截止目前已發(fā)現(xiàn)的可使哺乳動(dòng)物細(xì)胞發(fā)生永生化的唯一一類(lèi)真核生物，為寄生蟲(chóng)與宿主相互作用研究提供了理想模型。截至目前，人們已經(jīng)揭示了可轉(zhuǎn)化淋巴細(xì)胞泰勒蟲(chóng)參與調(diào)控宿主細(xì)胞的部分機(jī)制，涉及到的分子有TashAT(Theileria

2、annulata macroschizont-specific AT hook-containing protein)、SVSP(subtelomere-encodedvariable secreted protein)等，并證明與NF-κB、ISG15、TGF-β、PI-3K、E2F等分子及凋亡調(diào)控路徑有關(guān)。目前，人們已經(jīng)證明了小泰勒蟲(chóng)TpSCOP(T.parva schizont-derived cytoskeleton-bindi

3、ngprotein)蛋白能夠激活宿主細(xì)胞的NF-κB通路，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)宿主細(xì)胞的調(diào)控。由于環(huán)形泰勒蟲(chóng)TaSDP（T.annulata schizont-derived protein）蛋白與已知的的小泰勒蟲(chóng)TpSCOP蛋白為同源蛋白。本研究對(duì)TaSDP基因進(jìn)行了原核表達(dá)，利用了原核表達(dá)獲得的重組蛋白制備了兔源多克隆抗體并對(duì)該蛋白在環(huán)形泰勒蟲(chóng)感染細(xì)胞上進(jìn)行了定位，同時(shí)運(yùn)用雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)就該蛋白對(duì)HEK293T細(xì)胞NF-κB信號(hào)通路的

4、影響做了初步的探索，確定了電穿孔轉(zhuǎn)染環(huán)形泰勒蟲(chóng)感染細(xì)胞的最佳電轉(zhuǎn)緩沖液和電壓，為研究環(huán)形泰勒蟲(chóng)TaSDP蛋白在轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞中的作用奠定基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下:
　　1.TaSDP基因的表達(dá)及TaSDP蛋白多克隆抗體的制備。利用PCR技術(shù)從環(huán)形泰勒蟲(chóng)cDNA中擴(kuò)增TaSDP基因，構(gòu)建原核表達(dá)載體進(jìn)行蛋白的表達(dá)，rTaSDP蛋白以包涵體的形式存在;將純化后的融合蛋白免疫家兔，制備多克隆抗體。制備的抗體不僅可與重組表達(dá)的His-TaS

5、DP發(fā)生反應(yīng)，而且可以識(shí)別天然的蟲(chóng)體蛋白，為開(kāi)展其在細(xì)胞調(diào)控方面的研究準(zhǔn)備了材料。
　　2.TaSDP蛋白在環(huán)形泰勒蟲(chóng)感染細(xì)胞中的定位。為探尋TaSDP蛋白在環(huán)形泰勒蟲(chóng)感染細(xì)胞內(nèi)的位置，以純化的抗rTaSDP蛋白免疫血清為一抗，運(yùn)用間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)，并借助于激光共聚焦顯微鏡對(duì)該蛋白進(jìn)行細(xì)胞定位。結(jié)果表明，TaSDP蛋白定位于環(huán)形泰勒蟲(chóng)裂殖體上。該蛋白可以作為一個(gè)標(biāo)記分子用于后續(xù)裂殖體相關(guān)的研究。
　　3.TaSDP蛋白對(duì)HE