36657.neuronatin基因表達(dá)及功能的初步研究

1、中山大學(xué)博士后學(xué)位論文Neuronatin基因表達(dá)及功能的初步研究姓名：余利紅申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士后專業(yè)：細(xì)胞生物學(xué)指導(dǎo)教師：余新炳20080601Neuronatin基因表達(dá)及功能初步研究膠質(zhì)細(xì)胞瘤、眼癌中呈中度表達(dá)；在正常大腦皮層、視網(wǎng)膜、胎盤、脊髓、胚胎干細(xì)胞和腹膜中呈低表達(dá)。(二)構(gòu)建重組載體，利用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)，使用熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)在HepG2細(xì)胞中表達(dá)Nnat／EGFP，兩種融合蛋白都具有細(xì)胞質(zhì)內(nèi)定位方式，在C6轉(zhuǎn)染細(xì)胞中使用

2、G418藥物篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)Nnat的細(xì)胞克隆。流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞牛長(zhǎng)周期，三種細(xì)胞無明顯差異，也未觀察到表達(dá)NnaVEGFP的C6細(xì)胞發(fā)生明顯凋亡。(三)使用RT—PCR檢測(cè)到Nnat基因在胚胎期大腦，從E9已開始表達(dá)，但表達(dá)量較低，隨著發(fā)育時(shí)間的增加，NnatmRNA的表達(dá)量逐漸增加，出生前后表達(dá)量最高。出生后無論是在大腦還是小腦中，NnatmRNA表達(dá)都是隨發(fā)育時(shí)期的增加，呈明顯下降趨勢(shì)，并在P60降到最低。(四)免疫組織化學(xué)染色

3、發(fā)現(xiàn)，Nnat蛋白在大腦的外囊，胼胝體，大腦深自質(zhì)，背側(cè)海馬聯(lián)合，扣帶束等處高表達(dá)，而在大腦皮層，海馬，尾殼核，丘腦等處低表達(dá)或沒有表達(dá)。Nnat蛋白表達(dá)陽(yáng)性部位呈束狀排列，內(nèi)部有纖維狀染色，周圍有膠質(zhì)細(xì)胞包繞。Nnat蛋白可能是髓鞘相關(guān)蛋白。(五)RNA干擾PCI2細(xì)胞Nnat的表達(dá)后，細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生明顯變化，由無規(guī)則的多角形或長(zhǎng)梭形變?yōu)橛幸?guī)則多角形或圓形，且細(xì)胞與細(xì)胞間的界限清晰，長(zhǎng)出尖細(xì)的突起，細(xì)胞集落消失，呈散在生長(zhǎng)。但免疫組化

4、并沒有檢測(cè)到神經(jīng)系統(tǒng)標(biāo)記基因的明顯變化。(六)RNA干擾能促進(jìn)NGF誘導(dǎo)下PCI2細(xì)胞突起生長(zhǎng)。野牛PCI2在NGF作用6h以后細(xì)胞開始長(zhǎng)出神經(jīng)突起，至48h時(shí)細(xì)胞變得扁平，呈梭形或多角形，胞體增大，部分細(xì)胞長(zhǎng)出突起，突起長(zhǎng)度約為胞體直徑一半左右，細(xì)胞分化不均，部分細(xì)胞沒有明顯的形態(tài)變化。RNAPCI2細(xì)胞在NGF作用6h可觀察到細(xì)胞折光度發(fā)牛改變，突起部位明顯延伸，至48小時(shí)細(xì)胞幾乎全部有長(zhǎng)的突起長(zhǎng)出，每個(gè)細(xì)胞周圍有3—5個(gè)突起，突起