RhoA基因在大腸癌組織中的表達(dá)及功能的初步研究.pdf

1、小G蛋白是指分子量20～30KD的單亞基G蛋白,已發(fā)現(xiàn)有100多種成員.根據(jù)其一級結(jié)構(gòu)的同源性及功能將它們分為Ras,Rho,Rab,Arf,sar1和Ran六個家族,具有復(fù)雜且重要的生物學(xué)功能.Rho即Ras相似物（Ras homologue）,Rho家族在細(xì)胞骨架重組和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用,而且近年來研究還發(fā)現(xiàn)Rho家族參與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程.而國內(nèi)尚未見Rho蛋白與腫瘤發(fā)生、發(fā)展間關(guān)系這方面的研究報道.因此,我們以大腸癌組織

2、和細(xì)胞株為研究對象,研究Rho家族是否參與大腸癌發(fā)生發(fā)展過程及其可能的作用機(jī)制.第一部分,RhoA基因在大腸癌組織中的表達(dá).首先我們研究了RhoA基因mRNA在大腸癌組織中的表達(dá).建立測定大腸癌組織RhoA基因mRNA表達(dá)的逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)最適條件,在半定量水平測定42例大腸癌手術(shù)標(biāo)本正常粘膜組織和大腸癌組織的RhoA基因mRNA表達(dá)的相對水平,并探討與臨床病理學(xué)指標(biāo)的關(guān)系.第二部分,構(gòu)建穩(wěn)定轉(zhuǎn)染RhoA-DN的大腸癌

3、細(xì)胞株LoVo-DN.顯性失活突變體RhoA(T19N)(下文簡稱RhoA-DN,Dominant negative)是第19位氨基酸從蘇氨酸突變?yōu)樘於０返腞hoA蛋白,這種蛋白能夠影響野生型RhoA和鳥苷酸交換因子(GEF)發(fā)生作用,從而抑制細(xì)胞中野生型RhoA功能.為了在細(xì)胞水平進(jìn)一步探討RhoA基因在人大腸癌發(fā)生發(fā)展中的可能作用及其機(jī)制.第三部分,抑制RhoA蛋白活性對人大腸癌細(xì)胞株LoVo生物活性的影響及其機(jī)制的初步研究.在實(shí)

4、驗(yàn)中可觀察到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染RhoA-DN抑制細(xì)胞內(nèi)源性RhoA蛋白活性后,LoVo-DN細(xì)胞發(fā)生形態(tài)改變,由梭形或紡錘形變?yōu)槎噙呅位驁A形.同時發(fā)現(xiàn)細(xì)胞生長緩慢.因此進(jìn)行細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)并繪制生長曲線,發(fā)現(xiàn)LoVo-DN細(xì)胞的體外增殖速度較對照明顯減慢.將LoVo、LoVo-PC和LoVo-DN腫瘤細(xì)胞接種T淋巴細(xì)胞缺陷型裸鼠,建立大腸癌動物模型,發(fā)現(xiàn)LoVo-DN細(xì)胞的體內(nèi)增殖亦明顯減慢(P<0.01).通過流式細(xì)胞技術(shù)(FCM)分析細(xì)胞周期發(fā)現(xiàn)

5、LoVo-DN細(xì)胞周期阻滯于G<,0>/G<,1>期(P<0.01).提示抑制RhoA功能可使腫瘤細(xì)胞生長停滯于G<,0>/G<,1>期,抑制人大腸癌細(xì)胞株LoVo的體內(nèi)體外增殖.該研究發(fā)現(xiàn)大腸癌組織中RhoA基因表達(dá)較相應(yīng)正常粘膜組織高,且RhoA基因表達(dá)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,腫瘤分期相關(guān).進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)抑制RhoA功能使大腸癌細(xì)胞株p21<'Cip1>表達(dá)上調(diào),使腫瘤細(xì)胞生長停滯于G<,0>/G<,1>期,從而抑制其體內(nèi)體外增殖,并可能通過