家蠶特有基因的鑒定、表達(dá)模式分析及功能初探.pdf

1、昆蟲是地球上種類最豐富的動(dòng)物群體，在生態(tài)系統(tǒng)中占據(jù)重要地位。昆蟲形態(tài)多樣，種類繁多，其物種與形態(tài)的多樣性是在長(zhǎng)期進(jìn)化過程中對(duì)復(fù)雜的生存環(huán)境逐漸適應(yīng)的結(jié)果。然而，物種的多樣性與生理功能之間存在不可分割的聯(lián)系，換句話說是遺傳物質(zhì)決定了物種的生物學(xué)性狀。隨著越來越多基因組序列的測(cè)定，從基因組水平去研究物種特有基因的功能可能會(huì)為物種在分化、行為習(xí)性和形態(tài)上區(qū)別于其它生物提供重要線索。
　　 家蠶是典型的鱗翅目模式昆蟲，也是被人類馴化的重

2、要經(jīng)濟(jì)昆蟲。家蠶及更多物種的全基因組序列的測(cè)定為我們研究家蠶特有基因提供了平臺(tái)。物種特有基因是指與其它物種沒有同源性的可編碼蛋白的基因序列，亦被稱為“孤兒基因”或“ORFans”。對(duì)基于家蠶基因組序列的家蠶特有基因乃至鱗翅目特有基因的研究，可以幫助我們了解特有基因在家蠶體內(nèi)行使的特殊功能，還可以幫助我們了解家蠶在馴化過程中導(dǎo)致適應(yīng)性變異產(chǎn)生的機(jī)理，為未知功能基因的研究提供基礎(chǔ)信息。本研究獲得的主要結(jié)果如下：
　　 1.家蠶特有基

3、因的鑒定及序列分析
　　 利用家蠶、蜜蜂、果蠅、按蚊、伊蚊、赤擬谷盜、線蟲、人和原雞等幾個(gè)物種的基因組序列及Butterflybase數(shù)據(jù)庫(kù)中鱗翅目昆蟲所有報(bào)道的基因序列，通過同源序列比對(duì)的方法，鑒定了家蠶、蜜蜂、果蠅、按蚊、伊蚊及赤擬谷盜六個(gè)昆蟲基因組中的特有基因。在家蠶基因組中，特有基因共有2051個(gè)，占所有預(yù)測(cè)基因的14％，我們還鑒定出在家蠶基因組中有340個(gè)基因?yàn)轺[翅目特有基因。蜜蜂、果蠅、按蚊、伊蚊和赤擬谷盜的基因組中

4、分別有特有基因878、2611、1078、1383和4142個(gè)；各占了基因組的7.9％、12％、8.2％、8.2％和24.8％。EST數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，在家蠶特有基因和鱗翅目特有基因中，分別有911和227個(gè)基因具有EST表達(dá)證據(jù)。結(jié)合家蠶基因功能注釋信息分析表明，有85個(gè)家蠶特有基因具有功能注釋信息，鱗翅目特有基因有105個(gè)具有功能注釋信息，這些具有功能注釋的基因多是以基因家族形式存在，我們將其功能注釋分為七大類。家蠶特有基因(含鱗翅目特

5、有基因)中有1710個(gè)基因是以單拷貝形式存在，其它基因?qū)儆?71個(gè)基因家族，如癱瘓肽家族、抗菌肽家族、表皮蛋白等。
　　 2.家蠶特有基因時(shí)空及免疫表達(dá)模式分析
　　 基于家蠶全基因組Oligo芯片數(shù)據(jù)，在2391個(gè)特有基因中，1535個(gè)基因具有對(duì)應(yīng)的探針序列。分析這些基因在家蠶五齡3天各組織的表達(dá)情況顯示，有567個(gè)基因至少在一個(gè)組織中檢測(cè)到表達(dá)，其中，組織特異表達(dá)的基因有268個(gè)，推測(cè)這些基因可能與組織特異的生理途徑

6、相關(guān)；還有63個(gè)基因具有組織共表達(dá)特征。在早期胚胎芯片中共檢測(cè)到468個(gè)基因表達(dá)，在早期胚胎中有近200個(gè)基因表達(dá)。對(duì)家蠶幼蟲四齡發(fā)育時(shí)期芯片分析顯示有623個(gè)基因檢測(cè)到表達(dá)，有16個(gè)基因只在蛻皮期表達(dá)，推測(cè)可能與蛻皮過程相關(guān)；還有14個(gè)基因僅在食桑期表達(dá)。結(jié)合家蠶變態(tài)發(fā)育時(shí)期的芯片數(shù)據(jù)，結(jié)果表明家蠶特有基因中640個(gè)基因具有表達(dá)信號(hào)，大部分基因在雌雄中具有相似的表達(dá)模式，小部分基因的表達(dá)水平在雌雄中差異較大，推測(cè)與精子或卵子的發(fā)生與發(fā)

7、育相關(guān)?；诖竽c桿菌、黑胸?cái)⊙?、白僵菌和NPV四種微生物誘導(dǎo)的家蠶免疫芯片分析家蠶特有基因的誘導(dǎo)情況，結(jié)果顯示有451個(gè)基因具有表達(dá)差異。
　　 3.利用RNAi手段探索候選基因的功能
　　 以具有EST證據(jù)、熟蠶期高量表達(dá)和單拷貝基因?yàn)楹Y選條件，篩選到13個(gè)候選基因，利用RNAi干擾實(shí)驗(yàn)初步探討這些基因的功能。表型觀察發(fā)現(xiàn)有6個(gè)基因得到了不同的表型改變，多數(shù)基因表現(xiàn)為蛻皮受阻，即無法蛻掉幼蟲的皮。BGIBMGA0007

8、02基因取得較明顯的表型變化，所有處理均可成功蛻皮，但是在RNAi處理后72h左右蛹的身體開始縮短，并逐漸死亡。對(duì)干涉?zhèn)€體進(jìn)行解剖發(fā)現(xiàn)，相較于對(duì)照而言，處理后的蛹體液含量明顯減少，其它組織沒有明顯變化，推測(cè)這個(gè)基因可能通過某種特殊的生理途徑影響了蛹的發(fā)育，是蛹發(fā)育過程中的一個(gè)必需基因。實(shí)時(shí)熒光定量PCR顯示該基因進(jìn)行RNAi干涉處理后在mRNA水平表達(dá)下調(diào)，且與dsRNA處理后的雌蛹相比較，其在雄中表達(dá)量下調(diào)更明顯。該基因在發(fā)育時(shí)期的R

9、T-PCR表達(dá)譜顯示其在熟蠶期開始表達(dá)上調(diào)且在雄中表達(dá)量較高，而蛹2天組織表達(dá)譜顯示在各組織均有表達(dá)，并在卵巢、精巢和頭中表達(dá)量較高。
　　 4.BGIBMGA000702基因的原核表達(dá)及western blotting檢測(cè)
　　 信息分析發(fā)現(xiàn)BGIBMGA000702基因由一個(gè)外顯子組成，ORF框?yàn)?88bp，編碼195個(gè)氨基酸，蛋白預(yù)測(cè)分子量為23kDa，等電點(diǎn)為9.64，位于1號(hào)染色體上。將該基因整個(gè)編碼區(qū)序列亞克

10、隆到p28表達(dá)載體上構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化到Rosetta(DE3)表達(dá)菌株。通過IPTG誘導(dǎo)重組菌000702/p28/Rosetta(DE3)表達(dá)蛋白，得到一個(gè)約25kDa的重組蛋白，其中標(biāo)簽為6×His Tag約為2kD，目的蛋白約23kDa，與預(yù)測(cè)分子量相符合。蛋白組分鑒定表明該重組蛋白主要以包涵體形式表達(dá)。利用western blotting檢測(cè)該蛋白在發(fā)育過程中的表達(dá)情況顯示其在胚胎、熟蠶階段高量表達(dá)；Western bl

11、otting檢測(cè)RNAi干涉后蛋白表達(dá)情況表明該蛋白表達(dá)量明顯下調(diào)，說明瞬時(shí)干涉可以引起該基因蛋白水平的表達(dá)下調(diào)。
　　 綜上所述，本文鑒定了家蠶、果蠅等六個(gè)昆蟲基因組中特有基因及鱗翅目昆蟲特有基因，并詳細(xì)分析了家蠶和鱗翅目特有基因的序列信息及時(shí)空和免疫芯片表達(dá)譜，最后利用RNAi干擾實(shí)驗(yàn)和原核表達(dá)及western blotting初步探索了BGIBMGA000702基因的功能。本研究鑒定的家蠶特有基因?qū)榧倚Q特有的生理過程及生