家蠶BmZFP16-like基因cDNA的克隆、表達及功能初探.pdf

1、家蠶是鱗翅目的模式昆蟲，具有重要的經(jīng)濟價值，其絲腺是一種高度特異化且能夠高效地合成絲蛋白的器官，研究表明絲蛋白基因的表達主要是在轉錄調控水平上進行的，這是目前研究的熱點。鋅指蛋白是一類在真核細胞中普遍存在的與細胞內核酸特異性結合的轉錄因子。本研究發(fā)現(xiàn)了在家蠶絲腺特異表達的并且含有C2H2型ZFP結構域的轉錄因子—BmZFP16-like，采用克隆、表達、qRT-PCR、western blot等技術對其生物信息學特征、轉錄水平以及蛋白質

2、水平的組織表達模式進行了分析，探討了BmZFP16-like在家蠶絲素重鏈蛋白基因的轉錄調控中的作用。獲得的主要研究結果如下：
　　1、通過在GenBank中與其它鱗翅目昆蟲鋅指蛋白保守序列比對，設計特異性引物進行克隆、測序，序列分析表明該基因的ORF序列為984 bp，編碼327個氨基酸，預測該蛋白分子量為37.4 kDa，其等電點為6.15。該蛋白質C末端含有6個高度保守的ZFP結構域，屬于ZFP家族，進化分析表明該序列與黑脈

3、金斑蝶鋅指類蛋白ZFP16同源性較高，因此命名為BmZFP16-like。
　　2、構建了原核表達質粒pET28a-BmZFP16-like，轉化至E. coli Transetta(DE3)，用不同濃度 IPTG進行誘導表達。SDS-PAGE和 Western blot的檢測結果表明BmZFP16-like融合蛋白能夠在原核表達系統(tǒng)中高效表達。通過Ni柱親和層析純化了該重組蛋白，并制備了多克隆抗體。
　　3、分別提取家蠶絲

4、腺等不同組織及家蠶不同發(fā)育時期絲腺的RNA和總蛋白，通過熒光定量PCR和Western blot分析家蠶BmZFP16-like在不同組織及不同發(fā)育時期的轉錄水平和蛋白表達情況。結果表明 BmZFP16-like基因的表達存在相對的時空特異性，其中在絲腺中的表達量最高，在脂肪體中表達量最低，從四眠后期開始逐漸升高，到五齡7天達到最高，到預蛹期基本不表達，這一表達模式與絲素重鏈基因（fib-H）的表達模式類似。
　　4、提取不同品種

5、（P50和H9）的絲腺RNA和總蛋白，運用熒光定量PCR法和免疫印跡法檢測絲腺中 BmZFP16-like的轉錄表達水平和蛋白表達情況。結果顯示BmZFP16-like基因在H9中的表達量要高于P50，由此推測BmZFP16-like基因很可能參與fib-H基因的轉錄調控。
　　5、對BmZFP16-like與fib-H的表達調控區(qū)相互作用分析，BmZFP16-like第二個鋅指結構域α螺旋區(qū)的3個氨基酸可以與fib-H啟動子的5