家蠶表皮生長因子基因cDNA的克隆及表達特征分析.pdf

1、表皮生長因子（epidermal growth factor, EGF）是由前體proEGF分解而成的，表皮和細胞的功能可被其改變，具有促進細胞生殖、分化和治愈傷口創(chuàng)傷等特性，目前EGF主要被用于滋潤皮膚和修復(fù)創(chuàng)傷等研究。本實驗主要研究家蠶EGF基因cDNA的克隆、轉(zhuǎn)錄變化及和蛋白重組表達情況。
　　本實驗根據(jù)與家蠶EGF基因相關(guān)的公共數(shù)據(jù)庫的序列信息，設(shè)計了專一性引物，經(jīng)克隆和測序獲得一段家蠶BmEGF基因的cDNA序列，可知B

2、mEGF基因ORF654 bp，有217個氨基酸被編碼，利用相關(guān)生物信息學(xué)軟件分析了其分子特征，且鄰接法構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹顯示家蠶與黑脈金斑蝶親緣關(guān)系最近，與果蠅親緣關(guān)系稍微近一些，而與線蟲動物中豬鞭蟲和旋毛蟲的親緣關(guān)系距離較遠。
　　家蠶中不同齡期和不同組織的總RNA被提取，而后以M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶合成第一鏈cDNA，以家蠶18S rRNA基因做為內(nèi)參基因，進行了qRT-PCR。結(jié)果表明BmEGF基因在組織中表達量呈現(xiàn)不同程度的變

3、化，但BmEGF基因在不同時期和不同組織中的表達是有差異的。在蠶卵催青胚胎發(fā)育過程中，BmEGF均有表達并且催青第9d表達量較高；BmEGF在幼蟲發(fā)育過程中的各齡期蛻皮階段都有表達，4次蛻皮BmEGF表達量均在眠期最高，各齡將眠相對眠起來說表達量高些，在幼蟲5齡7 d，BmEGF基因在表皮和中腸中的表達量最高，在絲腺中的表達量次之，在精巢和卵巢中的表達量較低；在蛹-蛾變態(tài)發(fā)育時期，上蔟3d至4d剛化蛹，BmEGF基因表達量上調(diào)；化蛹6d

4、復(fù)眼變黑，BmEGF在脂肪體中表達量較高；化蛾當(dāng)天BmEGF在精巢和卵巢中表達量較高。
　　使用NPV﹑白僵菌﹑大腸桿菌﹑藤黃微球菌四種微生物誘導(dǎo)處理家蠶幼蟲，利用real-time PCR技術(shù)以家蠶18S rRNA為內(nèi)參基因檢測表皮中BmEGF的轉(zhuǎn)錄情況。結(jié)果表明在家蠶H95齡3 d幼蟲的表皮中，BmEGF基因表達量隨著時間的延長呈現(xiàn)先上調(diào)后降低的變化；經(jīng)大腸桿菌誘導(dǎo)處理后的表皮中BmEGF轉(zhuǎn)錄水平在3h達到峰值，其他三種菌則是

5、在6h達到峰值；在這四種菌中，BmEGF對大腸桿菌的侵染較為敏感，對NPV侵染響應(yīng)應(yīng)答較慢，表明BmEGF在病原微生物處理后的家蠶幼蟲的免疫過程，可能起到一定的抗性作用。
　　將已測定的ORF片段與pET-28a(+)表達載體連接構(gòu)建重組質(zhì)粒，并通過加入不同濃度的IPTG誘導(dǎo)其原核表達，SDS-PAGE電泳和Western blot均證明BmEGF的目的蛋白在E.coli Transetta(DE3)菌株中被誘導(dǎo)表達成功。且高濃度