池蝶蚌表皮生長(zhǎng)因子受體底物15(Eps15)基因的分子特征及表達(dá)分析.pdf

1、本研究利用實(shí)驗(yàn)室已有的池蝶蚌（Hyriopsis schlegelii）轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中表皮生長(zhǎng)因子受體底物15（Eps15）基因的部分序列，設(shè)計(jì)池蝶蚌Eps15基因(Hs-Eps15)基因的特異性引物，并以池蝶蚌性腺組織cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將擴(kuò)增產(chǎn)物克隆到pMD19-T載體中，然后轉(zhuǎn)進(jìn)大腸桿菌DH5α，經(jīng)測(cè)序獲得Hs-Eps15基因的部分中間片段，繼而通過(guò)PCR和3’-RACE PCR最終克隆出Eps15基因序列，其cDNA全長(zhǎng)

2、3382bp，包括923bp的3'-UTR，具有24bp長(zhǎng)的polyA尾巴及加尾信號(hào)AATAA，開(kāi)放閱讀框(Open reading frame，ORF)為2454bp，編碼817個(gè)氨基酸。對(duì)Hs-Eps15蛋白結(jié)構(gòu)域分析得知，N端部分主要由三個(gè)EH(Eps15 homology)結(jié)構(gòu)域組成，無(wú)信號(hào)肽，而C端部分最顯著的特征是存在多次DPF(谷氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸)重復(fù)序列；利用相關(guān)生物學(xué)軟件分析得到其分子量約為88.67kDa，理論

3、等電點(diǎn)為4.88；二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)中顯示無(wú)規(guī)則卷曲和α-螺旋最多，分別占41.74％和41.49%，延伸鏈占9.55，β-折疊最少。采用MEGA4.0軟件鄰位相連法（NJ）建立系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析同源性表明，在眾多物種中，池蝶蚌的Eps15基因與太平洋牡蠣（Crassostrea gigas）的同源性最高（約64%）。
　　通過(guò)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)分析Hs-Eps15基因在池蝶蚌不同組織中mRNA的表達(dá)情況。結(jié)果表明：該基因在池蝶蚌心臟、

4、卵巢、精巢、腸、肝胰腺、腎臟、鰓、閉殼肌、外套膜、斧足和血液11個(gè)組織中均有表達(dá)，其中在精巢中表達(dá)量最高，在卵巢中次之，而在心臟、鰓和血液中表達(dá)量較低，其中心臟中最低。由此推測(cè)池蝶蚌中以Eps15為底物的EGFR通路會(huì)影響精子的產(chǎn)生和發(fā)育，也會(huì)作為池蝶蚌卵巢局部重要的調(diào)節(jié)因子，影響卵泡生長(zhǎng)發(fā)育及成熟。
　　根據(jù)已得到的Hs-Eps15基因的全長(zhǎng)cDNA序列，經(jīng)NCBI中比對(duì)獲知序列N端有3個(gè)EH結(jié)構(gòu)域，選取這段完整且具有代表性結(jié)構(gòu)

5、域的序列，并對(duì)此設(shè)計(jì)擴(kuò)增該完整結(jié)構(gòu)域的引物，pEASYTM-E1-Hs-Eps15重組表達(dá)質(zhì)粒，然后轉(zhuǎn)進(jìn)E.coil BL21(DE3)表達(dá)感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，得到了分子量約為32.6kDa的融合蛋白。采用Ni-NTA樹(shù)脂親和層析法純化表達(dá)產(chǎn)物，SDS-PAGE檢測(cè)顯示獲得了純凈的融合蛋白，Bradford法測(cè)定蛋白濃度及含量，測(cè)定結(jié)果顯示蛋白濃度符合制備多克隆抗體的要求。利用純化的Hs-Eps15融合蛋白作為抗原免疫

6、日本長(zhǎng)耳兔，制備多克隆抗體，ELISA間接法檢測(cè)抗血清效價(jià)在1:512000以上。經(jīng)Western blotting檢測(cè)得知制備的多克隆抗血清能夠特異性識(shí)別純化的Hs-Eps15融合蛋白。最后做池蝶蚌成熟性腺及肝胰腺的冰凍切片，用制備的兔抗血清對(duì)Hs-Eps15蛋白在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)進(jìn)行免疫熒光定位，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在池蝶蚌的精子中，Eps15蛋白主要分布在精子頭部位置，在池蝶蚌卵細(xì)胞中，Eps15蛋白主要分布在細(xì)胞核膜上，而在肝胰腺細(xì)胞中Eps15