家蠶新基因BmEm4的克隆，表達(dá)與功能研究.pdf

1、果蠅中的剪切增強(qiáng)子m4基因E(spl)m4是受到microRNA調(diào)控的靶基因，它通過參與Notch信號(hào)途徑來調(diào)節(jié)果蠅的神經(jīng)發(fā)育，而目前關(guān)于家蠶的Notch信號(hào)途徑及其相關(guān)蛋白的研究仍然是一片空白。
　　 我們通過RT-PCR的方法從家蠶中克隆得到果蠅E(spl)m4的同源基因命名為Bm Em4/ Bombyx mori E(spl)m4]，GenBank登錄號(hào)為FJ436408。該基因ORF框大小為477bp,編碼158個(gè)氨基酸

2、，預(yù)測(cè)分子量為18.01KD。通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)該基因3’非編碼區(qū)含有一些高度保守的模體（例如Brd盒子，GY盒子，K盒子和CAAC模體）和兩個(gè)潛在的microRNA結(jié)合位點(diǎn)。我們將擴(kuò)增到的Bm Em4基因克隆到融合表達(dá)載體pET-28a相應(yīng)的酶切位點(diǎn)上，得到融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-BmEm4，經(jīng)PCR、酶切鑒定以及測(cè)序證明重組子是正確的。將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3),IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后經(jīng)SDS-PAGE分析，

3、在24 kDa左右的位置有一條特異性蛋白條帶以包涵體的形式表達(dá)，與預(yù)期值(融合標(biāo)簽3.56 kDa， BmEm418.01 kDa)基本相符，經(jīng)質(zhì)譜鑒定正確。我們用Ni柱親和層析的方法純化帶有His標(biāo)簽的融合蛋白，將純化得到的融合蛋白免疫新西蘭兔制得多克隆抗體，ELISA檢測(cè)該抗血清的效價(jià)可達(dá)到1:25600以上。我們用該抗體來檢測(cè)該蛋白的組織分布和亞細(xì)胞定位。通過免疫印跡、免疫組化和實(shí)時(shí)熒光定量PCR試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)BmEm4在家蠶不同發(fā)育時(shí)

4、期的mRNA轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達(dá)水平明顯不一致。我們通過Western blotting和免疫組化發(fā)現(xiàn)該蛋白在家蠶發(fā)育各時(shí)期中蛹和幼蟲時(shí)的表達(dá)量較高，而在卵和蛾中很難檢測(cè)到表達(dá)。但是熒光定量PCR結(jié)果顯示該基因在卵時(shí)期的mRNA水平最高，這與該時(shí)期很難檢測(cè)到蛋白表達(dá)相矛盾。另外BmEm4蛋白在第三天的五齡幼蟲的頭部、表皮、腸、氣管以及快要吐絲的五齡幼蟲的卵巢中都有表達(dá)，其中頭部表達(dá)量最高，而在脂肪體、睪丸、馬氏管和絲腺中很難檢測(cè)到表達(dá)，各

5、個(gè)組織的mRNA水平和蛋白水平基本一致。亞細(xì)胞定位結(jié)果表明，該蛋白主要存在細(xì)胞質(zhì)中。我們推測(cè)BmEm4和果蠅E(spl)m4基因的功能相似，在家蠶的神經(jīng)發(fā)育過程中起著重要作用并有可能受到microRNA的調(diào)控。此外，我們還用梯度濃度的Notch信號(hào)途徑阻斷劑DAPT處理家蠶BmN細(xì)胞，之后提取細(xì)胞的總RNA和總蛋白，用熒光定量PCR和Western blotting的方法檢測(cè)Bm Em4基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)水平變化。結(jié)果顯示，隨著處理濃度的