家蠶NEDD8功能及其Neddylation修飾蛋白的鑒定.pdf

1、蛋白質(zhì)翻譯后修飾是蛋白質(zhì)發(fā)揮功能的重要調(diào)節(jié)機制，包括磷酸化、乙?；?、糖基化、泛素化以及類泛素化等。Neddylation修飾是一種類似于泛素化修飾的蛋白質(zhì)翻譯后修飾機制，參與細胞增殖與發(fā)育、DNA損傷修復、蛋白質(zhì)穩(wěn)定性、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、染色體形成、細胞凋亡與自噬等重要的生物學過程，并與一些病毒的復制有關。家蠶是生產(chǎn)上的一種重要的經(jīng)濟昆蟲，也是科學研究領域的一種重要的模式生物。家蠶核型多角體病毒（Bombyx mori Nuclear Poly

2、hedrosis Virus， BmNPV）對于家蠶來說是一種重要的致病病原，每年都給蠶業(yè)生產(chǎn)造成了重大損失。本課題從克隆 Neddylation修飾途徑關鍵基因 NEDD8開始，研究了家蠶NEDD8基因的特征，并探討了Neddylation修飾與家蠶核型多角體病毒復制的關系，主要結(jié)果如下：
　?。?）根據(jù) NCBI數(shù)據(jù)庫登錄的基因信息從家蠶細胞中成功克隆出 NEDD8基因，ORF大小為234bp，共編碼77個氨基酸，蛋白質(zhì)分子質(zhì)

3、量約為8.47kDa，無信號肽。NEDD8氨基酸序列與其他模式生物及家蠶泛素相關蛋白質(zhì)具有高度保守性，且家蠶 NEDD8與家蠶的泛素序列一致性最高。熒光定量 PCR檢測顯示NEDD8在家蠶五齡幼蟲不同組織中均有表達，其中頭部中表達量最高，其次是絲腺中，而在精巢和卵巢中表達量最低。NEDD8在家蠶5齡第3天幼蟲始到化蛹后第3天mRNA表達量逐漸增加，在化蛹后第9天時達到最高，化蛾時降低。通過構(gòu)建GFP融合表達的重組BmNPV感染家蠶BmN

4、細胞，在共聚焦顯微鏡下定位顯示NEDD8在BmN細胞內(nèi)普遍存在，分布于整個細胞中，并且在感染48 h后存在細胞質(zhì)內(nèi)的聚集現(xiàn)象。
　?。?）利用Neddylation修飾特異性抑制劑MLN4924研究了Neddylation修飾對BmNPV的作用，結(jié)果顯示MLN4924對BV粒子產(chǎn)生的影響和多角體形成的影響有顯著的抑制效果，并且病毒DNA復制和病毒蛋白的表達都受到了抑制，但對BV病毒粒子對細胞的吸附、侵入沒有顯著影響。
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5、3）運用免疫共沉淀和 LC-ESI-MS/MS質(zhì)譜分析方法來篩選家蠶細胞中NEDD8修飾的相關蛋白。從家蠶BmN細胞中總共篩選出28個NEDD8修飾的可能底物蛋白，28個家蠶蛋白中有17個能夠被匹配到GO中，其中分子功能條目下，42.86％和46.43%的蛋白分別參與結(jié)合和催化活性；細胞組成條目下，26.83%，26.83%和19.5%的蛋白分別被歸類為細胞、細胞部分和細胞器；參與的生物過程條目下，30%，24%和8%蛋白分別參與代謝、