家蠶蠶蛾毛結(jié)構(gòu)蛋白的鑒定.pdf

1、鱗翅目昆蟲是威脅農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的最大害蟲類群，為減少其對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的危害，人們每年使用大量化學農(nóng)藥以控制害蟲數(shù)量。但化學農(nóng)藥的濫用，不但對環(huán)境造成污染，威脅人們的健康，而且在消滅害蟲的同時也對非靶標生物產(chǎn)生了不良影響。
　　 鱗翅目昆蟲翅面具有色彩斑斕的圖案，其翅面的鱗毛是鱗翅目昆蟲區(qū)別于其它生物的典型特征，也是鱗翅目昆蟲偽裝和擬態(tài)的主要構(gòu)成要件。鱗毛由表皮的毛原細胞形成，是一種具有精細結(jié)構(gòu)的表皮衍生物。鱗毛具有調(diào)節(jié)溫度的功能，增加了蟲

2、體對環(huán)境溫度的適應性。鱗毛精密結(jié)構(gòu)與光線相互作用，從而產(chǎn)生了結(jié)構(gòu)色，人們對結(jié)構(gòu)色的產(chǎn)生機理做了大量研究，但其機理仍然有待研究。
　　 家蠶(Bombyx mori)具有詳盡的基因組數(shù)據(jù)信息，是鱗翅目昆蟲研究的模式生物。因此，本論文從分子生物學的角度著手，以家蠶(Bombyx mori)成蟲鱗毛為研究對象，利用家蠶基因組數(shù)據(jù)庫、EST數(shù)據(jù)庫和表達芯片數(shù)據(jù)庫，采用SDS抽提和胰蛋白酶直接消化相結(jié)合的蛋白提取方法，利用LC-MS/MS

3、調(diào)查了家蠶鱗毛的蛋白質(zhì)構(gòu)成。另外，采用RNAi技術(shù)，研究了部分表皮蛋白基因?qū)倚Q鱗毛表型的影響，獲得以下主要結(jié)果：
　　 1.家蠶鱗毛的蛋白質(zhì)構(gòu)成
　　 本研究采用SDS抽提和胰蛋白酶直接消化相結(jié)合的方法，提取家蠶(Bombyxmori)成蟲鱗毛蛋白質(zhì)，并利用LC-MS/MS對所獲得的肽段進行了鑒定，進而將在鱗毛中發(fā)現(xiàn)的175個肽段與基于由silkDB、家蠶cDNA數(shù)據(jù)庫以及NCBI構(gòu)建的本地數(shù)據(jù)庫進行比對，總共鑒定獲得

4、40個蛋白。其中包括7個不可溶性表皮蛋白，它們是通過使用胰蛋白酶直接消化SDS抽提后剩余的沉淀所獲得的，首次在鱗毛中發(fā)現(xiàn)表皮蛋白。這些表皮蛋白中有一半以上是屬于BmCPG蛋白家族。而在SDS抽提的蛋白中，發(fā)現(xiàn)31個非表皮蛋白，他們分屬于9類蛋白質(zhì)：(1)肌肉蛋白，(2)蛋白酶與抑制劑，(3)轉(zhuǎn)運蛋白，(4)新陳代謝與糖代謝相關(guān)蛋白，(5)蛋白分泌相關(guān)蛋白，(6)熱激蛋白，(7)氧化還原相關(guān)蛋白，(8)儲存蛋白，(9)其它類的蛋白質(zhì)。

5、r>　　 2.家蠶鱗毛表皮蛋白基因的功能
　　 為進一步研究部分家蠶表皮蛋白基因?qū)倚Q鱗毛和鱗片臼表型的影響，我們在蛹期對家蠶蛹注射siRNA，通過RNA干涉研究家蠶鱗毛表皮蛋白基因的功能。結(jié)果表明，注射了siRNA的家蠶羽化后，在表型上未能發(fā)現(xiàn)明顯差異。采用實時定量PCR檢測了RNAi后家蠶四個表皮蛋白基因BmCPG1、BmCPR2、BmCPR63、BmCPG11的表達水平，結(jié)果與對照(注射EGFPsiRNA)相比均有不同程

6、度的下降，這表明所注射siRNA干擾了家蠶表皮蛋白基因的正常表達。隨后我們用掃描電子顯微鏡(SEM)觀察了RNAi后家蠶鱗毛及鱗片臼的表型變化，結(jié)果表明，與對照組鱗毛相比，RNAi后家蠶鱗毛的脊脈寬度和間距都有減小的趨勢，同時鱗片臼的密度和直徑也有減小的趨勢。我們推測家蠶鱗毛表皮蛋白基因表達量的降低導致表皮蛋白的合成減少，進而使得毛原細胞沒有足夠的材料來完成鱗毛的構(gòu)建。特別是在不同干涉組的鱗毛中均觀察到鱗毛表面的脊脈出現(xiàn)了大量的分叉與交

7、叉，形成麻花狀或串珠狀脊脈，這也可能是表皮蛋白基因被干涉后，毛原細胞無法及時調(diào)整其鱗毛發(fā)育過程而出現(xiàn)的一種發(fā)育紊亂。
　　 本研究首次從鱗毛中鑒定出了40個蛋白質(zhì)，其中包括7個表皮蛋白，并對家蠶蛹期BmCPG1、BmCPR2，BmCPR63、BmCPG11四個表皮蛋白基因進行RNAi以研究這些基因?qū)[毛表型的影響。我們推測，表皮蛋白是家蠶鱗毛的重要組成成分，對鱗毛發(fā)育和功能的完整性起到重要的作用，是鱗毛構(gòu)建其精密結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵蛋白質(zhì)