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文檔簡介
1、家蠶(Bombyxmori)是卵滯育性鱗翅目模式昆蟲,受親代卵孵化期(催青期)溫度、光節(jié)律等環(huán)境因子誘導,并受產(chǎn)下后溫度誘導決定表現(xiàn)。本文以經(jīng)典的家蠶滯育卵誘導條件催青期蠶卵及胚后幼蟲與蠶蛹,調(diào)查家蠶滯育激素基因dh、滯育特征能量代謝限速酶山梨醇脫氫酶基因sdh、家蠶滯育生物鐘蛋白基因ea4以及家蠶抗氧化酶基因sod和過氧化氫酶基因cat的表達譜,從滯育誘導與活化調(diào)控相關(guān)基因表達與環(huán)境互作的角度研究了家蠶活化的分子機制。主要獲得了以下結(jié)
2、果:
1.家蠶5個滯育相關(guān)基因的表達存在顯著的組織和性別差異性
家蠶大造品種5齡幼蟲期基因芯片表達譜顯示,dh基因、adh基因和cat表達水平存在性別差異與組織差異,雌蠶的多個組織dh基因表達水平都顯著低于雄性;雄蠶的sdh基因表達豐度顯著高于雌蠶,而卵巢的sdh基因表達豐度高于精巢;cat基因除在卵巢的表達水平高于精巢外,其它組織的表達量都低于雄性。ea4基因、sod基因和cat基因在不同組織中的表達有顯著
3、差異性,ea4基因和sod基因在后部絲腺都只有痕跡量表達,而表達豐度最高的組織分別為頭部和體壁,cat則在不同組織中的表達有極顯著的差異性。
10個家蠶品種的ESTs表達譜分析顯示,ea4基因表達具有組織(器官)和發(fā)育時期的差異性,前胸腺表達最高,而生殖腺沒有表達;成蟲期表達量顯著高于其它發(fā)育時期,其中剛羽化成蟲的前胸腺與被微生物感染5齡幼蟲的脂肪體中ea4基因表達豐度顯著上調(diào)。
2.誘導子代滯育卵發(fā)生的高溫
4、與光照條件上調(diào)家蠶dh基因表達
催青期在誘導子代滯育卵發(fā)生的高溫25℃與持續(xù)光照條件下,蠶卵有穩(wěn)定的、高水平dh基因mRNA存在,而誘導子代非滯育卵發(fā)生的低溫15℃與持續(xù)黑暗條件下,蠶卵中幾乎檢測不到dh基因的mRNA存在。在25LL或者20LD催青環(huán)境中,胚胎發(fā)育至單眼形成后(積溫高于2160℃.h),蠶卵中的dh基因表達水平開始顯著上調(diào),這與在此階段的蠶卵胚胎對滯育誘導環(huán)境溫度和光節(jié)律更加敏感相一致,但dh基因表達水平
5、沒有出現(xiàn)隨不同滯育誘導溫度或光節(jié)律變化的振蕩節(jié)律,表明蠶卵胚胎的dh基因表達受到滯育誘導溫度和光照這兩個近日節(jié)律授時因子的影響,但不是節(jié)律授時因子直接調(diào)控的基因。
從催青期開始的整個世代保護溫度和光照,對家蠶胚后時期砌基因的表達水平影響,呈現(xiàn)高溫25℃上調(diào)dh基因的表達。親代卵孵化期的催青溫度與光照,影響了子代卵的滯育性,也影響了子代卵內(nèi)的dh基因mRNA水平,但這種影響與蠶卵的滯育性不完全一致。
3.親代卵
6、高溫環(huán)境催青能夠下調(diào)家蠶整個世代sdh基因表達
催青期的25℃高溫和持續(xù)光照,顯著下調(diào)蠶卵sdh基因表達;在20LD催青條件下,蠶卵sdh基因靈敏地受到滯育誘導溫度和光照這兩個近日節(jié)律授時因子的影響,但沒有出現(xiàn)隨不同滯育誘導溫度變化的振蕩節(jié)律;整個世代維持在誘導子代卵發(fā)生滯育的25LL環(huán)境下,幼蟲至蠶蛾時期各階段體內(nèi)(生殖腺)sdh基因的表達水平總體低于20LD環(huán)境;親代不同溫度孵化處理結(jié)果表明,25℃條件下子代卵在孵化后
7、期進入滯育,sdh基因的轉(zhuǎn)錄水平也隨之降低。
4.光照對該環(huán)境中的蠶卵和子代卵的sdh基因表達影響不同
親代卵催青期低溫條件下的持續(xù)光照,有顯著下調(diào)蠶卵sdh基因表達的作用;親代催青期低溫條件下的持續(xù)光照,有上調(diào)子代卵sdh基因表達的作用。催青期光照對處于該光照環(huán)境中的親代蠶卵和子代卵的sdh基因表達影響呈現(xiàn)相反的結(jié)果。
5.家蠶TIME-EA4的滯育生物鐘活性不依賴基因表達水平的上調(diào)
8、 雖然催青期在15DD環(huán)境中,蠶卵ea4基因轉(zhuǎn)錄水平顯著低于25LL,和20LD環(huán)境,但溫度和光照節(jié)律的振蕩改變,沒有出現(xiàn)相應(yīng)的蠶卵胚胎的ea4基因轉(zhuǎn)錄水平變化。胚后時期家蠶幼蟲與蠶蛹的ea4基因具有發(fā)育階段與組織(器官)的顯著表達差異,在不同滯育誘導環(huán)境之間也有差異,但與滯育誘導發(fā)生條件無明顯關(guān)聯(lián),而是與自由基代謝相關(guān)。
子代卵滯育發(fā)生和活化過程中ea4基因的表達結(jié)果顯示,授精前(處女蛾卵)都具有高水平ea4mRNA
9、存在,而授精后0.5h-12h迅速被降解;合子形成后,轉(zhuǎn)錄本水平逐漸升高,滯育性卵在卵齡12h、無滯育性卵在卵齡24h后達到授精前水平,并在24h-72h的滯育發(fā)生期,以及72h以上的滯育完成期,一直維持此水平,也無滯育性差異。鹽酸活化處理卵齡24h的滯育性卵,卵內(nèi)EA4的ATPase活性在處理后1.5h左右出現(xiàn);5℃低溫冷藏卵齡48h的滯育性卵,活性則在冷藏13d左右出現(xiàn),但這2個過程都沒有檢測到ea4基因轉(zhuǎn)錄水平升高。提示家蠶滯育性
10、卵活化啟動時的EA4生物鐘活性出現(xiàn)不依賴ea4基因表達。
6.棉鈴蟲ea4同源基因的克隆、分子進化及組織表達
Haea4基因全長eDNA799bp,編碼199個氨基酸。蛋白序列分析表明,Haea4分子量18768.88,等電點5.45。Haea4基因有明顯的信號肽序列,屬于分泌蛋白。含有Cu/ZnSOD核心結(jié)構(gòu)域、N-糖基化位點、N-?;稽c、酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點和蛋白激酶C磷酸化位點。蛋白同源性分析結(jié)果
11、表明,HaEA4在不同物種中的保守性較高。分子進化分析表明,棉鈴蟲和家蠶、野桑蠶的TIME-EA4同源蛋白質(zhì)都與Cu-Zn/SOD蛋白的進化距離較近,蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)分析也顯示,棉鈴蟲與家蠶的TIME-EA4基本特性有很大相似性。該基因在棉鈴蟲不同組織中的表達有一定差異,中腸、脂肪體、體壁表達量較高,頭部、生殖腺、絲腺表達量相對較低,提示Haea4基因的分布與酯酶發(fā)揮代謝解毒的功能是一致的。氨基酸遺傳距離和同源性分析表明,棉鈴蟲的TIME
12、-EA4與家蠶和野蠶間的遺傳距離分別為0.536,0.548,同源性均為44%。
7.滯育誘導溫度和光節(jié)律對家蠶抗氧化酶基因sod和過氧化氫酶基因cat表達譜的影響
催青期25LL環(huán)境,蠶卵sod基因表達除孵化時顯著下調(diào)外,其它時期有高水平的sodmRNA存在;20LD催青環(huán)境,蠶卵sod基因表達量高于15DD,在孵化后期胚胎神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育完全后更加顯著;cat基因在25LL、20LD和15DD環(huán)境之間的表達量
13、沒有顯著差異,孵化后期(積溫2160-3600℃.h),cat基因表達水平顯著上調(diào),這與在此階段的蠶卵胚胎對滯育誘導環(huán)境溫度和光節(jié)律更加敏感相一致。
sod基因在人工活化卵中的表達水平顯著高于非浸酸的滯育性卵;卵齡24-192h,25LL條件下子代卵逐漸進入滯育,sod基因表達量下調(diào);溫度和光照對家蠶子代卵期sod基因的表達水平影響,呈現(xiàn)低溫黑暗上調(diào)sod基因的表達。cat基因在人工活化卵初期mRNA水平下降,低于滯育性卵
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