家蠶滯育生物鐘蛋白質EA4基因的結構以及時空表達研究.pdf

1、家蠶是卵滯育昆蟲，蠶業(yè)生產上通過低溫冷藏和鹽酸處理等方法解除蠶卵滯育。酯酶A4(EsteraseA4，EA4)是一種能夠感受蠶卵活化所需低溫時間或酸刺激而發(fā)生蛋白質空間結構變化，獲得瞬時ATPase活性的時間間隔測定酶(TIME)，被稱作家蠶滯育生物鐘蛋白質。 本實驗以家蠶C108品種為材料，根據本實驗室完成的eα4基因cDNA的ORF序列(NCBI登陸號：DQ086424)，利用快速擴增cDNA末端法獲得了其全長cDNA。測序

2、結果表明，eα4基因全長cDNA 606 bp，ORF為519 bp，編碼172個氨基酸。根據NCBI家蠶基因組數據，推斷家蠶eα4基因至少含有4個外顯子、3個內含子。由于家蠶全基因組數據存在缺口，通過拼接、修復GAP得到eα4基因從第2個外顯子到第4個外顯子全部序列，但第1個內含子序列未能確定。 用核酸雜交技術以及半定量RT-PCR方法調查了eα4基因在家蠶5齡幼蟲和蛹期不同組織的表達情況。隨機引物地高辛(digoxygeni

3、n，DIG)標記eα4基因cDNA的核酸點雜交結果表明，在家蠶5齡幼蟲和蛹期，eα4基因的表達不存在組織和性別特異性。采用Actin3基因做陽性對照，RT-PCR檢測eα4基因的表達譜，結果在家蠶5齡幼蟲和蛹期，eαt4，基因不存在發(fā)育時期的表達特異性，在絲腺、造血器官、中腸和脂肪體eα4基因的mRNA表達量較高，而在卵巢中表達量較低。證明了EA4蛋白質可能由家蠶造卵時期的幼蟲至成蟲期親代非特異性合成后儲存于卵。 為了在基因表達

4、水平進一步研究EA4蛋白質的生物測時機理，根據家蠶蛋白質EA4具有卵期瞬時ATPase活性(即生物鐘活性)和整個卵期超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，SOD)活性的特點，本文研究了家蠶以及野桑蠶eα4基因cDNA、EA4蛋白及SOD蛋白結構特點。比較家蠶和野桑蠶(NCBI：DQl54907)的eα4基因，兩者的ORF同源性97％，蛋白同源性為99％?？寺∫吧ＰQ的Cu/Zn-sod基因cDNA(NCBI登陸號：AM

5、410997)后，推測的家蠶與野桑蠶SOD蛋白質氨基酸同源性為100％，家蠶EA4與SOD蛋白質的同源性為46％。家蠶EA4與Cu/Zn-SOD蛋白質有著相似的活性位點，包括金屬配基氨基酸和二硫鍵，但N末端的相似性不高，這是EA4的特有結構，這部分是β-折疊重復空間結構，柔軟可動，推測為EA4的計時功能的活性中心，是瞬時ATPase計時活性出現的關鍵結構，而EA4的鋼性結構域可能是一直具有SOD活性的結構基礎。從基因和蛋白質結構分析推測