生物鐘基因表達在基礎(chǔ)藥理、毒理學(xué)研究的意義.pdf

1、本文對生物鐘基因表達在基礎(chǔ)藥理、毒理學(xué)研究的意義進行了探討。本研究分為四個部分：
　　第一部分：人原發(fā)性肝癌中金屬巰蛋白和生物鐘基因表達紊亂。
　　目的：生物鐘紊亂與許多疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，但是對人原發(fā)性肝癌生物鐘的表達鮮有報道。本課題組前期研究表明，與肝癌相關(guān)的金屬巰蛋白基因表達呈明顯生物節(jié)律的變化，因此，本實驗探究肝癌患者的癌組織和癌旁組織中金屬巰蛋白和生物鐘基因的表達。
　　方法：本實驗的標(biāo)本皆由北京解放軍

2、醫(yī)院東方肝移植中心提供，包括36例健康的肝組織、24例肝癌患者的癌旁組織和癌組織。提取樣品組織的RNA通過實時熒光定量方法（RT-qPCR）檢測人原發(fā)性肝癌組織中金屬巰蛋白和生物鐘基因的表達。
　　結(jié)果：與正常肝組織相比，在肝癌組織和癌旁組織中，金屬巰蛋白基因MT-1、MT-2和MFT-1表達下降，且在肝癌組織中金屬巰蛋白基因表達下降最多。生物鐘核心基因Bmal1、Clock和生物鐘負(fù)反饋基因Per1、Per2、Cry1、Cry2

3、在癌組織及與其相對的癌旁組織中表達也均下降，且在癌組織中表達下降最多。相反地，在癌組織及其相對的癌旁組織中，生物鐘鐘控基因Nr1d1和Dbp的表達上升。
　　結(jié)論：該研究發(fā)現(xiàn)，在原發(fā)性肝癌的癌組織和癌旁組織中，金屬巰蛋白和生物鐘基因表達紊亂，這可能為原發(fā)性肝癌的防治提供新思路。
　　第二部分：重復(fù)錳暴露誘導(dǎo)下丘腦和肝臟中生物鐘基因表達的紊亂。
　　目的：金屬錳（Mn）具有神經(jīng)毒性，其癥狀表現(xiàn)為非運動障礙和運動障礙，也被

4、稱為錳中毒，其中運動障礙表現(xiàn)為帕金森樣（PD）癥狀。帕金森病人和錳中毒患者均表現(xiàn)生物節(jié)律的紊亂，時鐘基因是唯一驅(qū)動和維持生物節(jié)律的基因。但是，重復(fù)Mn暴露對生物鐘基因表達的影響卻知之甚少，因此本實驗探究了生物鐘基因在錳中毒的SD大鼠下丘腦和肝臟中的表達。
　　方法：雄性SD大鼠腹腔注射MnCl2·4H2O，給藥劑量分別為1 mg/kg和5 mg/kg。隔天給藥，每天給藥一次。給藥四周后，進行轉(zhuǎn)棒實驗。給藥30天后，取腦和肝臟組織，

5、通過RT-qPCR法檢測生物鐘基因的表達。通過免疫組化法，檢測中腦黑質(zhì)內(nèi)多巴胺神經(jīng)元的變化和皮質(zhì)中小膠質(zhì)細(xì)胞的變化。
　　結(jié)果：重復(fù)錳暴露引起神經(jīng)毒性，導(dǎo)致中腦黑質(zhì)內(nèi)多巴胺神經(jīng)元數(shù)量減少、小膠質(zhì)細(xì)胞激活，且呈現(xiàn)劑量依賴型。在錳中毒大鼠的下丘腦和肝臟中，生物鐘核心基因Bmal1、Clock、Npas2和生物鐘負(fù)反饋基因Cry1、Per1、Per2表達降低，且隨著給錳劑量的增加，生物鐘核心基因和負(fù)反饋基因的表達下降更明顯。然而，生物鐘

6、靶基因Dbp、Nr1d1在錳中毒大鼠的下丘腦和肝臟中表達卻增加。
　　結(jié)論：重復(fù)錳暴露可以引起下丘腦和肝臟的生物鐘基因表達紊亂，肝臟生物鐘基因?qū)﹀i中毒引起的時鐘基因表達紊亂更具有易感性。
　　第三部分：慢性脂多糖和魚藤酮誘導(dǎo)的帕金森模型大鼠伴隨生物鐘基因和蛋白的表達異常。
　　目的：脂多糖誘導(dǎo)的慢性神經(jīng)炎癥加重魚藤酮的神經(jīng)毒性，成功模擬帕金森疾病的模型。生物鐘紊亂與許多神經(jīng)退行性疾病相關(guān)。因此本部分實驗研究在帕金森模型

7、大鼠中，生物鐘基因和蛋白的表達。
　　方法：雄性SD大鼠（約180 g），在LPS（5 mg/kg, ip x1）注射200天后，腹腔注射魚藤酮（0.5 mg/kg, sc x20，5次/周）4周。給予魚藤酮3周后，進行行為學(xué)檢測，包括轉(zhuǎn)棒實驗、曠場實驗、Y迷宮實驗。末次給藥10天后取大腦組織，免疫組化檢測（TH染色和OX42染色）和大腦皮質(zhì)線粒體活性檢測，確定帕金森模型造模的成功，在此基礎(chǔ)上通過RT-qPCR方法檢測生物鐘基因和

8、蛋白的表達變化，
　　結(jié)果：在脂多糖和魚藤酮聯(lián)合誘導(dǎo)的慢性帕金森模型中，大鼠的運動功能受到損傷，在轉(zhuǎn)棒實驗中，與對照組相比，Rot組和L+R組大鼠在棒上停留時間下降了25.6％；曠場實驗中，Rot組和L+R組大鼠運動距離下降了54%；在Y迷宮實驗中，L+R組大鼠自發(fā)性選擇正確率下降了30%。大腦皮質(zhì)組織中線粒體活性檢測發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，LPS組、Rot組、LPS+Rot組線粒體活性均降低，且LPS+Rot組線粒體活性降低最多。與

9、對照組相比，單獨給與LPS或Rot和LPS+Rot聯(lián)合用藥使生物鐘核心基因Bmal1、Clock、Npas2，生物鐘負(fù)反饋基因Per1、Per2、Cry1、Cry2，生物鐘靶基因Nr1d1、Dbp以及生物鐘蛋白BMAL1、CLOCK、NR1D1、DBP表達均降低，且在LPS+Rot聯(lián)合用藥組，生物鐘基因和蛋白下降最明顯，并且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)論：脂多糖和魚藤酮聯(lián)合給藥可以成功模擬帕金森模型，帕金森疾病大鼠大腦皮質(zhì)生物鐘基

10、因和蛋白的表達紊亂。
　　第四部分：藏藥佐太對小鼠肝臟生物鐘基因的影響。
　　目的：生物鐘在維持機體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)和代謝方面起著重要作用。生物鐘可以影響藥物代謝，藥效和毒理作用。相反地，藥物也可以影響生物鐘的表達。佐太是藏藥的珍寶藥，具有鎮(zhèn)靜，解毒，減毒增效的作用。但是佐太的藥理作用尚不清楚，因此，本實驗探究藏藥佐太對生物鐘的影響，為尋找佐太藥理作用的靶點提供新思路。
　　方法：60只雄性昆明種小鼠購買于第三軍醫(yī)大學(xué)動物

11、中心，隨機分為12個組，每組5只。在SPF級動物房適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后，選7-12組給予佐太，給藥劑量為10 mg/kg，連續(xù)給藥7天，同時，1-6組每天給予生理鹽水。七天后，先將小鼠麻醉，分別于6:00、10:00、14:00、18:00、22:00和2:00取肝臟組織。不同時間點取的肝組織分別提取總RNA，通過RT-qPCR檢測生物鐘基因的表達。
　　結(jié)果：藏藥佐太降低10點肝臟生物鐘核心基因Clock，Npas2，Bmal1的表