毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)

1、毒理學(xué)實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)一 實(shí)驗(yàn)動物的一般操作技術(shù),一、目的,二、內(nèi)容（一）實(shí)驗(yàn)動物的選擇 1、物種的選擇：嚙齒類、非嚙齒類 基本原則：代謝、生化、毒理學(xué)特征與人最接近的自然壽命不太長的易于飼養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)操作的經(jīng)濟(jì)且易于獲得的,2、品系的選擇：遺傳學(xué)控制分類近交系：純品系，經(jīng)至少連續(xù)20代的全同胞兄妹之間或親代與子代之間交配培育而成的動物雜交群：F1代，兩個不同近交系之間進(jìn)行有計(jì)劃的交配.雜交所產(chǎn)生的第一代動物，即

2、F1代動物封閉群：5年內(nèi)，隨機(jī)交配。一個種群動物位于固定地點(diǎn)，5年以上不從外部引進(jìn)任何新種,僅在群內(nèi)隨機(jī)交配繁殖遺傳均一性：一種毒物固定使用同種品系,3、微生物學(xué)和寄生蟲控制的選擇Ⅰ級：普通動物，開放系統(tǒng)飼養(yǎng)Ⅱ級：清潔動物，屏障系統(tǒng)飼養(yǎng)Ⅲ級：SPF動動，屏障/隔離系統(tǒng)飼養(yǎng)Ⅳ級：無菌動物，隔離系統(tǒng)飼養(yǎng),4、個體選擇性別：年齡：急性、慢性以體重估計(jì)：組內(nèi)、組間差異生理狀態(tài)：雌--未產(chǎn)未孕，避免妊娠、激素影響健康狀況：

3、健康動物健康動物辨認(rèn)：,健康動物辨認(rèn)：外觀體形豐滿，被毛濃密有光澤、緊貼體表，眼睛明亮，行動迅速、反應(yīng)靈活，食欲及營養(yǎng)狀況良好。(1)眼：明亮，瞳孔雙側(cè)等圓，無分泌物。(2)耳，耳道無分泌物溢出，耳殼無膿瘡。(3)鼻：無噴嚏，無漿性粘液分泌物。(4)皮膚：無創(chuàng)傷、無膿瘡、疥癬、濕疹。(5)頸部：要求頸項(xiàng)端正，如有歪斜提示可能存在內(nèi)耳疾患，不應(yīng)選作實(shí)驗(yàn)動物。(6)消化道：無嘔吐、腹瀉，糞便成形，肛門附近被毛潔凈。(7)神經(jīng)

4、系統(tǒng)：無震顫、麻痹。若動物(大鼠、小鼠)出現(xiàn)圓圈動作或提尾倒置呈圓圈擺應(yīng)放棄該動物。(8)四肢及尾：四肢、趾及尾無紅腫及潰瘍。,（二）動物性別鑒定(1)大鼠、小鼠：主要依肛門與生殖孔間的距離區(qū)分，間距大者為雄性，小者為雌性。成年雄鼠臥位可見到辜丸，雌性在腹部可見乳頭。(2)豚鼠；用一只于抓住豚鼠頸部，另一只手扒開靠生殖器孔的皮膚，雄性動物在圓孔中露出性器官的突起，雌性動物則顯示三角形間隙，成年雌性豚鼠胸部有兩個乳頭。,（三）動物抓

5、取正確地抓取固定動物，既不損害動物健康、不影響觀察指標(biāo)，又防止被動物咬傷(1)小鼠：先用右手抓取鼠尾提起，置于鼠籠或?qū)嶒?yàn)臺上向后拉，在其向前爬行時，用左手拇指和食指抓住小鼠的兩耳和頸部皮膚，將鼠體置于左手心中，把后肢拉直，以無名指按住鼠尾，小指按住后腿即可。 尾靜脈注射時，可使用特殊的固定裝置進(jìn)行固定,如尾靜脈注射架或粗的玻璃試管。如要進(jìn)行手術(shù)或心臟采血應(yīng)先行麻醉再操作,如進(jìn)行解剖實(shí)驗(yàn)則必須先行無痛處死后再進(jìn)行。,(2)大鼠

6、：大鼠的抓取基本同小鼠，只是大鼠比小鼠性情兇猛，不易用襲擊方法抓取。為避免咬傷，可帶上帆布或棉紗手套。采用左手固定法，用拇指和食指捏住鼠耳，余下三指緊捏鼠背皮膚，置于左掌心中。,(3)豚鼠：豚鼠膽小易驚，在抓取時要穩(wěn)、準(zhǔn)、迅速。用手掌迅速扣住鼠背，抓住其肩胛上方，以拇指和食指環(huán)握頸部，另一只手托住臀部即可。(4)兔：用右手抓住兔頸部的毛皮提起，然后左手托住其臀部或腹部，讓其體重的大部分重量集中在左手上。注意不要抓取雙耳或抓提腹部。,（

7、四）實(shí)驗(yàn)動物稱重、編號、標(biāo)記項(xiàng)圈耳緣孔口標(biāo)記：染色法：苦味酸、品紅,耳緣孔口標(biāo)記：用耳號鉗在耳上打洞或者用剪刀在耳邊緣剪缺口，左耳為十位，右耳為個位。（五）動物隨機(jī)分組：隨機(jī)數(shù)字表,（六）染毒途徑和方法經(jīng)口（胃腸道）染毒喂飼：不易揮發(fā)、不易水解、無異味、不影響營養(yǎng)吞咽膠囊：灌胃：灌前禁食空腹，不飲水，灌胃容積0.1～0.2ml/10g小鼠、大鼠或豚鼠：左手抓住鼠背部及頸部皮膚將動物固定，右手持注射器，將灌胃

8、針插入動物口中，沿咽后壁徐徐插入食管。針插入時應(yīng)無阻力，若感到阻力或動物掙扎，應(yīng)立即停止進(jìn)針或?qū)⑨槹纬觯悦鈸p傷或穿破食管及誤入氣管。,經(jīng)呼吸道染毒靜式吸入動式吸入氣管內(nèi)注入,經(jīng)皮膚染毒斑貼法（家兔）被毛的去除：剪毛、拔毛、脫毛浸尾法（大、小鼠）注射染毒：靜脈注射、肌肉注射、腹腔注射、皮下注射、皮內(nèi)注射,（七）生物標(biāo)本采集 1.血液采集：大、小鼠鼠尾采血法眼眶靜脈叢采血法腹主動脈或股動(靜)脈采血法斷頭采血法

9、家兔耳緣靜脈采血法心臟采血法,實(shí)驗(yàn)動物安全采血量,2.尿液、糞便收集：代謝籠,（八）動物處死脊椎脫臼法斷頭法急性大失血法擊打法麻醉致死法,麻醉后急性放血法空氣栓塞法化學(xué)藥物致死法開放性氣胸法,微核實(shí)驗(yàn)動物染毒,陰性對照組：生理鹽水陽性對照組：環(huán)磷酰胺40-60mg/kg高劑量組：敵敵畏20mg/kg中劑量組：敵敵畏10mg/kg低劑量組：敵敵畏5mg/kg,實(shí)驗(yàn)二急性經(jīng)口毒性試驗(yàn),一、目的掌握LD50 計(jì)算

10、方法和急性毒性分級標(biāo)準(zhǔn)熟悉經(jīng)口灌胃技術(shù)了解急性毒性試驗(yàn)的設(shè)計(jì)原則,急性毒性、急性毒性分級標(biāo)準(zhǔn),急性毒性：一次或多次接觸，短時間產(chǎn)生的毒性效應(yīng)，包括一般行為和外觀改變，大體形態(tài)改變以及死亡效應(yīng)等。農(nóng)藥的急性毒性分級：低、中、高、劇毒,LD50計(jì)算方法,改良寇氏法：計(jì)算簡便，準(zhǔn)確率高，常用霍恩法序貫法Bliss法,改良寇氏法要求,每組動物數(shù)相等各劑量組組距呈等比級數(shù)死亡呈正態(tài)分布最低劑量組死亡80%,二、原理,健康動物?按

11、體重隨機(jī)分組?一次或多次經(jīng)口給藥?觀察中毒特征或死亡?劑量-反應(yīng)關(guān)系?求出LD50 ?毒性分級,三、材料與試劑,動物：昆明種小白鼠器材：注射器、灌胃針、見到、鑷子、試劑瓶、標(biāo)簽筆、移液槍等（課下交還）試劑：敵敵畏，苦味酸,四、步驟,動物選擇劑量設(shè)計(jì)：5-8個劑量（一般不設(shè)對照組）動物稱重、編號、標(biāo)記受試物配制灌胃：0.1-0.2ml/10g體重觀察：急性毒性試驗(yàn)原始記錄,劑量設(shè)計(jì)：預(yù)實(shí)驗(yàn)：文獻(xiàn)LD50=50-92mg/k

12、g設(shè)置400、200、100、50、25mg/kg 五個劑量，每劑量3只鼠。找出LD100和LD0 組距i=（lgLD100-lgLD0）/（n-1）n是實(shí)驗(yàn)組數(shù)；i是正式實(shí)驗(yàn)中兩個相鄰劑量組的劑量對數(shù)之差,A: lg200=2.301B: lgx=2.301-iC: lgy=2.301-2iD: lgz=2.301-3iE: lgw=2.301-4iF: lg50=1.690,1：k系列稀釋法最大劑量組濃度C1 （

13、母液濃度）C1=200mg/kg=2mg/10g0.2ml/10g→2mg/0.2ml=10mg/ml每組最大體積m=20ml（設(shè)每只鼠需2ml）k：相鄰兩組劑量之比=64.89/85.981=0.75V總=m/（1-k）=81.53ml（各組母液和）,敵敵畏原液濃度：1400mg/ml稀釋成10mg/ml，81.53ml的母液1400mg/ml*Vx=10mg/ml*81.53ml Vx=0.582ml V水=

14、81.53-0.582第1組 20ml第2組 剩余母液+20ml水→混勻后取20ml以此類推,,LD50計(jì)算：LD50及95%可信區(qū)間,,計(jì)算公式,m=Xk-i(∑p-0.5),m：lgLD50 i:相鄰兩劑量組對數(shù)值的差 Xk：最大劑量的對數(shù)值P：死亡率 q:存活率 n：每組動物數(shù)∑p=各劑量組死亡率總和,五、評價：毒性分級、毒性特征六、討論：,實(shí)驗(yàn)二皮膚刺激性/腐蝕性試驗(yàn)（豚鼠）

15、,試驗(yàn)?zāi)康?確定化學(xué)物對哺乳動物皮膚局部是否有刺激作用或腐蝕作用及其程度，為制定防護(hù)化學(xué)物對皮膚的刺激保護(hù)措施提供依據(jù)。,,皮膚刺激性(Dermal Irritation)：皮膚涂敷受試樣品后局部產(chǎn)生的可逆性炎性變化。皮膚腐蝕性(Dermal Corrosion)：皮膚涂敷受試樣品后局部引起的不可逆組織損傷。,試驗(yàn)的基本原則,將受試物一次(或多次)涂敷于受試動物的皮膚上，在規(guī)定的時間間隔內(nèi)，觀察動物皮膚局部刺激作用的程度并進(jìn)行評分。

16、采用自身對照，以評價受試物對皮膚的刺激作用。急性皮膚刺激性試驗(yàn)觀察期限應(yīng)足以評價該作用的可逆性或不可逆性。,,強(qiáng)酸或強(qiáng)堿物質(zhì)如pH≤2或pH≥11.5，由于可預(yù)見其腐蝕特性，不必做本試驗(yàn)；若已知受試樣品有很強(qiáng)的經(jīng)皮吸收毒性（LD50≤200mg/kg bw）的物質(zhì)不必進(jìn)行本試驗(yàn)；,試驗(yàn)方法,1、受試樣品液態(tài)受試樣品采用原液或人類實(shí)際應(yīng)用濃度固體受試樣品經(jīng)研磨，過100目篩后用水或適當(dāng)?shù)馁x形劑（如凡士林、阿拉伯樹膠、乙醇和水、羧甲基

17、纖維素、聚乙二醇、丙三醇、植物油和礦物油等）按一定比例調(diào)制，以保證與皮膚充分接觸。,2、實(shí)驗(yàn)動物和飼養(yǎng)環(huán)境,首選健康成年白色家兔，其次為白色豚鼠。至少需要4只健康成年動物（雄性和/或雌性均可）。每只動物相鄰的未處理的皮膚可作為對照。 每只單籠飼養(yǎng)，試驗(yàn)前動物要在實(shí)驗(yàn)室中適應(yīng)3d。常規(guī)飼料喂養(yǎng)，自由飲水,3、劑量設(shè)計(jì)受試樣品0.5ml(g)，均勻涂布于受試部位。如受試樣品難以獲得，或易產(chǎn)生全身毒性等原因，用量可適當(dāng)減少。但為了試

18、驗(yàn)的一致性，測試面積應(yīng)力求相等。,4、試驗(yàn)步驟,1）試驗(yàn)前準(zhǔn)備試驗(yàn)前24h，將實(shí)驗(yàn)動物脊柱兩側(cè)毛剪去或剃掉，不可損傷表皮，去毛范圍左右各3cm×3cm。24h后，選擇皮膚健康完整無損的動物進(jìn)行試驗(yàn)。不應(yīng)在長有濃密島狀毛的部位進(jìn)行受試樣品試驗(yàn)。,2） 染毒受試樣品0.5ml(g)直接涂布在皮膚上，用二層紗布（2.5cm×2.5cm）和一層玻璃紙或類似物覆蓋，再用無刺激性膠布和繃帶加以固定。另一側(cè)皮膚作為對照。采用封

19、閉試驗(yàn)，敷用時間為4h。,對化妝品產(chǎn)品而言，可根據(jù)人的實(shí)際使用和產(chǎn)品類型，延長或縮短敷用時間。對用后沖洗的化妝品產(chǎn)品，僅采用2 h敷用試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)束后用溫水或無刺激性溶劑清除殘留受試物。,如懷疑受試樣品可能引起嚴(yán)重刺激或腐蝕作用，可采用分段試驗(yàn)，將三個涂布受試樣品的紗布塊同時或先后敷貼于一只家兔背部脫毛區(qū)皮膚上，分別于涂敷后3min、60min和4h取下一塊紗布，皮膚涂敷部位在任一時間點(diǎn)出現(xiàn)腐蝕作用，即可停止試驗(yàn)。,3）觀察期限觀

20、察時間的確定應(yīng)足以觀察到可逆和不可逆刺激作用的全過程，一般不超過14d。于清除受試樣品后的1、24、48、72h分別觀察給予受試樣品部位的皮膚反應(yīng)，按表1進(jìn)行皮膚反應(yīng)評分，以受試動物積分的平均值進(jìn)行綜合評價，根據(jù)24、48和72h各觀察時點(diǎn)最高積分均值，按表2判定皮膚刺激強(qiáng)度。,,,5、試驗(yàn)報告,試驗(yàn)報告應(yīng)以表格形式總結(jié)，包括如下內(nèi)容：受試物名稱、理化性狀、配制方法和用量。必要時說明pH值實(shí)驗(yàn)動物種屬、品系、性別、體重和來源(合格

21、證號和級別)實(shí)驗(yàn)動物飼養(yǎng)環(huán)境：飼料來源、室溫、相對濕度、動物房合格證號每個動物在每一觀察時點(diǎn)的皮膚刺激反應(yīng)積分具體描述除刺激性以外的其它毒性作用結(jié)論,,,8 試驗(yàn)結(jié)果的解釋,急性皮膚刺激試驗(yàn)結(jié)果從動物外推到人的可靠性很有限。白色家兔和豚鼠在大多數(shù)情況下對有刺激性或腐蝕性的物質(zhì)較人類敏感。若用其它品系動物進(jìn)行試驗(yàn)時也得到類似結(jié)果，則會增加從動物外推到人的可靠性。試驗(yàn)中使用封閉式接觸是一種超常的實(shí)驗(yàn)室條件下的試驗(yàn)，在人類實(shí)際接

22、觸化學(xué)品過程中很少存在這種接觸方式。,附：多次皮膚刺激性試驗(yàn)步驟1 試驗(yàn)前將實(shí)驗(yàn)動物背部脊柱兩側(cè)被毛剪掉，去毛范圍各為2cm×3cm，涂抹面積2.5 cm×2.5cm。2 取受試物約0.5mL(g)涂抹在一側(cè)皮膚上，當(dāng)受試物使用無刺激性溶劑配制時，另一側(cè)涂溶劑作為對照，每天涂抹1次，連續(xù)涂抹14d。從第二天開始，每次涂抹前應(yīng)剪毛，用水或無刺激性溶劑清除殘留受試物。一小時后觀察結(jié)果，按表1 評分，對照區(qū)和試驗(yàn)區(qū)

23、同樣處理。,,結(jié)果評價：按下列公式計(jì)算每天每只動物平均積分，以表2判定皮膚刺激強(qiáng)度。,,,DDV：LD50：50～80 mg/kg(大鼠經(jīng)口)；75-107，113 mg/kg(大鼠經(jīng)皮)；LC50：15mg/ (大鼠吸入，4h)二甲苯：LD50：5000mg/kg（大鼠經(jīng)口）；LC50：1947mg/m3（大鼠吸入）;輕微粘膜刺激。引起皮膚發(fā)紅。家兔經(jīng)皮：500mg/24h，中度刺激甲醛：急性毒性：LD50800mg/kg（大

24、鼠經(jīng)口），2700mg/kg（兔經(jīng)皮）；LC50590mg/m3（大鼠吸入）；人吸入60～120mg/m3，發(fā)生支氣管炎、肺部嚴(yán)重?fù)p害；人吸入12～24mg/m3，，鼻、咽粘膜嚴(yán)重灼務(wù)、流淚、咳嗽；人經(jīng)口10～20ml，致死。,實(shí)驗(yàn)三小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn),一、目的：掌握小鼠骨髓PCE微核測定方法二、原理 染色體斷裂?染色體完整性 紡錘絲受影響?染色體分離改變有核細(xì)胞：難與核的分葉鑒別紅細(xì)胞：最后一次分裂后將主核排出（

25、PCE） PCE 24小時NCE（比PCE小1/5） 灰藍(lán)色 桔紅色,,三、材料、試劑試劑：受試物、陽性物、小牛血清、染液等動物器材,四、步驟動物選擇：雌雄各半劑量選擇：陰性、陽性對照，3-5個劑量組高、中、低劑量組： 1/5、1/10、1/20 LD50最高劑量組：動物分組、編號、標(biāo)記動物染毒：環(huán)磷酰胺（陽性對照實(shí)驗(yàn)）腹腔注射，20mg/kg，每組2只鼠 染毒次數(shù)：兩次或多次染

26、毒，每天染一次,涂片、固定、染色：脫臼處死?胸骨或股骨（股骨連接骨盆和小腿骨，取股骨保留股骨頭和膝蓋骨）?肌肉軟組織用紗布包上去除?剪掉兩端，移液槍吸血清（預(yù)熱）1ml放離心管中?1ml注射器吸血清，鑷子夾股骨沖洗骨髓細(xì)胞，1端沖洗3-5次，2端共沖洗6-10次?1000rpm離心10min?倒掉上清，留0.2-0.3ml上清?推片?晾干甲醇固定30-60s?吉姆薩染色10min,吉姆薩工作液：蒸餾水=1:9染色缸50ml染色后沖

27、洗無細(xì)胞的一側(cè)，顯微鏡觀察PCE鏡檢計(jì)數(shù)：PCE/NCE 200個 PCE微核率 1000個,,五、結(jié)果、統(tǒng)計(jì)分析與結(jié)論 陰性？ 陽性？,急性眼刺激試驗(yàn),實(shí)驗(yàn)?zāi)康模赫莆占毙匝鄞碳ぴ囼?yàn)原理、設(shè)計(jì)的基本方法、內(nèi)容及思路，操作方法，了解刺激強(qiáng)度判斷標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果判定。實(shí)驗(yàn)原理：用于評價受試物對哺乳動物眼睛是否有刺激作用或腐蝕作用及其程度。將受試物滴入或涂入動物一側(cè)眼結(jié)膜囊內(nèi)，

28、另一側(cè)用賦形劑作為對照。在停止接觸后的不同時間觀察角膜、虹膜及結(jié)膜的反應(yīng)情況，根據(jù)評分標(biāo)準(zhǔn)判斷受試物對眼刺激的強(qiáng)度。,（1）選擇家兔，稱重、編號，檢查動物雙眼，有無異常。3-4只/組（我們1只/組）（2）染毒：采用同體自身對照，輕輕拉開實(shí)驗(yàn)動物一側(cè)眼睛的下眼瞼，將配好的藥物0.1ml滴入或涂入一側(cè)眼結(jié)膜囊內(nèi)，另一側(cè)用賦形劑作為對照，給藥后使眼睛被動閉合一段時間后，用生理鹽水沖洗（規(guī)定84消毒液被動閉合時間為4s，30s后進(jìn)行沖洗，1h