環(huán)境毒理學實驗

1、環(huán)境毒理學實驗,授課教師：蘇增建試驗地點：環(huán)境毒理實驗室適用專業(yè)：環(huán)境科學相關(guān)專業(yè),實驗一 蚯蚓急性毒性實驗,一、目的與要求（1）學習和掌握濾紙接觸毒性實驗和人工土壤實驗的基本原理和方法。（2）初步了解評價環(huán)境中化學物質(zhì)對土壤中動物急生傷害的標準和基本步驟。,二、原理濾紙接觸法毒性實驗簡單易行，可對受試物毒性進行初篩。將蚯蚓與濕潤的濾紙上的受試物接觸，測定土壤中受試物對蚯蚓的潛在影響。人工土壤實驗系統(tǒng)將蚯蚓置于含不同濃度受試

2、物的人工土壤中，飼養(yǎng)7d和14d，評價其死亡率，評價受試物對蚯蚓的急性毒性作用。,實驗一 蚯蚓急性毒性實驗,實驗一 蚯蚓急性毒性實驗,三、設(shè)備與材料1、主要儀器和設(shè)備玻璃容器：平底玻璃管（3cm×8cm）培養(yǎng)裝置：光強400-800 lx的溫控培養(yǎng)箱中性濾紙：80-85g/m2移液器、塑料薄膜、烘箱、電吹風,實驗一 蚯蚓急性毒性實驗,2、試驗生物選用二月齡以上，體重300-500mg左右的健康赤子愛勝蚓。實驗前應

3、在實驗室條件下馴養(yǎng)2周以上。,實驗一 蚯蚓急性毒性實驗,3、人工土壤人工土壤基質(zhì)組成（干重）：（1）10%干牛糞（PH為5.5-6.0，磨細，風干，測定含水量）；（2）20%高嶺黏土（含50%以上高嶺土）；（3）70%石英沙（0.05-0.2mm粒徑的石顆粒50%以上）；（4）混合人工土壤的組成成分，加入蒸餾水使其含水量為干重的25%-42%，混合均勻。,實驗一 蚯蚓急性毒性實驗,四、方法和步驟1、清腸用蒸餾水清洗蚯蚓，然

4、后置于鋪有濾紙的磁盤上清腸24h，用去離子水沖洗后，濾紙吸干稱重，供試。注：清腸過程用薄膜包緊磁盤，防止蚯蚓爬出磁盤死亡。,實驗一 蚯蚓急性毒性實驗,2、濾紙實驗在平底試管內(nèi)壁襯濾紙，鋪滿不重疊；設(shè)5個濃度梯度（見附表）及對照共6組試管，每組≥10個重復，每個試管內(nèi)首先移取1ml對應濃度的受試物溶液，用潔凈空氣吹干，然后每個試管加入1ml去離子水，然后加入1條蚯蚓，用薄膜封口，在黑暗、20±2℃環(huán)境培養(yǎng)48h，每24h觀

5、察一次，記錄死亡情況，同時還有蚯蚓的病理癥狀和行為。,實驗一 蚯蚓急性毒性實驗,選擇濃度范圍的預試驗,注：受試物溶于水（≥1000mg/l）或丙酮等助溶劑，配成系列濃度,實驗一 蚯蚓急性毒性實驗,3、人工土壤試驗正式試驗前，需進行濃度范圍選擇實驗。最終設(shè)定至少5個濃度梯度級及空白組，濃度范圍應包括最大耐受濃度和致死濃度兩組濃度，每組至少有4個平行樣。受試蚯蚓需在人工土壤中先馴養(yǎng)24h，實驗前沖洗干凈。實驗進行14d，每7d觀察蚯蚓

6、的病理癥狀及行為、死亡。測定介質(zhì)中的含水量。,實驗一 蚯蚓急性毒性實驗,4、質(zhì)量控制可在實驗中加入陽性對照組（氯乙酰胺），空白組用去離子水代替受試物，實驗結(jié)束后空白對照組死亡率應不超過10%。,實驗一 蚯蚓急性毒性實驗,五、結(jié)果及實驗報告記錄不同受試物濃度對應的死亡情況，實驗報告就包括以下內(nèi)容：受試物的基本物化性質(zhì)；實驗動物的飼養(yǎng)條件等；試驗條件包括溫度、濕度、光照條件、實驗介質(zhì)的成分級成和制備條件；實驗結(jié)果報告。,實驗一 蚯蚓急

7、性毒性實驗,六、注意事項1、牛糞與其他人工土壤成分混合前應充分磨細風干、烘干，測定含水量；2、蚯蚓馴養(yǎng)條件：溫度18-22 ℃，持續(xù)光照（強度400-800 lx ），保證濕度；,實驗一 蚯蚓急性毒性實驗,3、實驗中管口或瓶口必須用薄膜封緊并保證通氣，防止蚯蚓鉆出；4、根據(jù)LC50值可將農(nóng)藥對蚯蚓的毒性劃分三個等級：10ppm的為低毒農(nóng)藥,實驗二 有機磷農(nóng)藥對膽堿酯酶活性的抑制,一、目的與要求1、了解有機磷殺蟲劑共同的特性，即

8、對昆蟲或高等動物體內(nèi)膽堿酯酶的活性能起抑制作用，而引起動物中毒死亡。2、利用這一原理測定各種有機磷殺蟲劑在動、植物體內(nèi)的殘留毒性，為安全使用農(nóng)藥提供依據(jù)。,實驗二 有機磷農(nóng)藥對膽堿酯酶的抑制實驗,二、原理當高等動物或昆蟲被有機磷殺蟲劑作用之后，體內(nèi)膽堿酯酶就受抑制，不能繼續(xù)起水解作用，因此，它們體內(nèi)的乙酰膽堿大量積累，而導致中毒死亡,實驗二 有機磷農(nóng)藥對膽堿酯酶的抑制實驗,三、設(shè)備與材料1、設(shè)備：可見光分光光度計；試管13支，移液

9、器；振蕩水浴鍋，燒杯，研缽。2、試劑：（1）0.004M溴化或氯化乙酰膽堿；（2）2M鹽酸羥胺溶液；（3）3.5N NaOH；（4）4N鹽酸溶液；（5）0.37M三氯化鐵溶液。,實驗二 有機磷農(nóng)藥對膽堿酯酶的抑制實驗,四、步驟與方法1、將臺面的大試管進行編號1-9（其中6號管為空白管，9號管為對照管），另有一支2ml有蓋管；2、每一排所有組將芽蟲放在一起，加入5倍左右的冷凍蒸餾水，進行研磨，然后將漿液全部倒入離心管中，在2500

10、rpm離心15min，取離心管中上清液作為正常蟲漿，共用；,實驗二 有機磷農(nóng)藥對膽堿酯酶的抑制實驗,3、各小組向2ml管加入0.5ml正常蟲漿，然后由老師幫忙加入20µl0.1%敵百蟲液，放置15分鐘；4、向1-6號管分別添加0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.0ml試劑（1），再分別加入1.3、1.1、0.9、0.7、0.5、0.5磷酸鹽緩沖液，搖勻；向7號管中分別加入0.5ml無處理的正常蟲漿，向8號管中加入0.

11、5ml敵百蟲處理過的蟲漿，然后分別向7-9號管加入1ml試劑（1），搖勻；,實驗二 有機磷農(nóng)藥對膽堿酯酶的抑制實驗,5、將6-9號管放入37℃振蕩水浴鍋中，40min后取出；6、向6號管中加入1ml試劑（4），搖勻后；7、分別向1-9號管中加入2ml試劑（2）與試劑（3）的混合液（1：1臨時配用），大力搖動1min以上；,實驗二 有機磷農(nóng)藥對膽堿酯酶的抑制實驗,8、向9號管中加入0.5ml正常蟲漿；9、除6號管外，分別向各管（1-

12、5號、7-9號）加入1ml試劑（4），搖勻；10、向1-9號管加入1ml試劑（5），各管即呈現(xiàn)深淺不同的紅棕色，用可見光光度計（540nm進行測定）。,實驗二 有機磷農(nóng)藥對膽堿酯酶的抑制實驗,五、結(jié)果與報告要求作出乙酰膽堿標準曲線，根據(jù)這條標準曲線求出樣本所含的乙酰膽堿量，從而計算出膽堿酯酶被抑制的百分率。,實驗二 有機磷農(nóng)藥對膽堿酯酶的抑制實驗,六、注意事項1、受試生物如果是荔枝蝽，則需雄雌各3頭，實驗時需去除雄性的睪丸，剪去翅