食品毒理學(xué)食品毒理學(xué)實(shí)訓(xùn)

1、第四章 食品毒理學(xué)實(shí)訓(xùn),實(shí)訓(xùn)一 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的飼養(yǎng)管理實(shí)訓(xùn)二 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組、標(biāo)記和染毒技術(shù)實(shí)訓(xùn)三 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物解剖和生物樣本采集、制 備技術(shù) 實(shí)訓(xùn)四 小鼠急性毒性試驗(yàn)實(shí)訓(xùn)五 小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)實(shí)訓(xùn)六 小鼠精子畸變?cè)囼?yàn),實(shí)訓(xùn)一 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的飼養(yǎng)管理,一、實(shí)訓(xùn)目的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的飼養(yǎng)管理是保障食品毒理學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)技術(shù)，通過(guò)本次實(shí)訓(xùn)了解實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房的環(huán)境要求及管理要點(diǎn)，掌握實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)管理的操作方法和程序，掌

2、握實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康的觀察和評(píng)價(jià)方法。,二、儀器和材料小鼠、大鼠、兔、飼養(yǎng)盒、墊料、水瓶及輔助器材、開(kāi)口器、體溫表等,三、操作方法 1.大、小鼠的日常飼養(yǎng)管理 (1) 進(jìn)入屏障動(dòng)物房的準(zhǔn)備 (2) 進(jìn)入動(dòng)物房后的觀察 (3) 大、小鼠的喂料 (4) 大、小鼠的喂水 (5) 大、小鼠換飼養(yǎng)盒 (6) 清潔衛(wèi)生和消毒 (7) 記錄,2.兔的日常飼養(yǎng)管理 (1) 工作人員進(jìn)入兔室前須著工

3、作服，穿膠鞋，戴口罩，戴手套、帽子。 (2) 進(jìn)入兔室后先觀察兔只健康狀況，記錄異常兔只并交由獸醫(yī)師處置。 (3) 飲水 (4) 飼料 (5) 衛(wèi)生消毒 (6)記錄,3.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康的觀察和評(píng)價(jià)（1）動(dòng)物的外表與行為觀察（2）個(gè)體檢查（3）采食和飲水觀察,四、實(shí)訓(xùn)結(jié)果1.計(jì)算動(dòng)物一晝夜之內(nèi)的攝食量和飲水量。2.對(duì)動(dòng)物進(jìn)行觀察檢查后，認(rèn)真填寫以下記錄表，作出相應(yīng)評(píng)價(jià)。,健康觀察記錄表動(dòng)物品系：,綜合評(píng)

4、價(jià)： 觀察人： 日期：,實(shí)訓(xùn)二 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的分組、 標(biāo)記和染毒技術(shù),一、實(shí)訓(xùn)目的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)的分組、標(biāo)記和合理的染毒是取得良好試驗(yàn)結(jié)果和結(jié)論的前提，也是每一項(xiàng)毒理學(xué)試驗(yàn)首先要做的工作。通過(guò)本次試驗(yàn)掌握實(shí)驗(yàn)動(dòng)物雌雄鑒別方法、科學(xué)分組、標(biāo)記和常用基本染毒技術(shù)。,二、儀器和材料 1．實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：成年健康小鼠、大鼠、豚鼠、家兔若干只。 2．染料：結(jié)晶紫、苦味酸、品紅。 3．毛筆

5、或棉簽。 4．動(dòng)物稱或天平 5．灌胃針,三、操作方法和步驟(一)健康動(dòng)物的選擇和性別鑒定1.健康動(dòng)物選擇：2.性別鑒定： ①大、小鼠；②豚鼠；③家兔。,（二)稱重、分組與標(biāo)記 1．稱重：根據(jù)不同試驗(yàn)要求，選擇不同體重的動(dòng)物。在同一組內(nèi)，同性別動(dòng)物體重差異應(yīng)小于平均體重的10％，組間同性別動(dòng)物體重均值應(yīng)小于5％。稱量大、小鼠體重時(shí)天平的感量要求在0.1 g以下。,隨機(jī)分組表,,3.編號(hào)及標(biāo)記（1）染色法。染料有苦

6、味酸酒精飽和液(黃色)、甲基紫酒精飽和液(紫色)或美藍(lán)溶液(藍(lán)色)、0.5％中性紅或品紅溶液(紅色)等。具體方法：a.按右上肩、右肋、右后肢、頸部、背中、尾根、左前肢、左肋、左后肢順序分別為1-9號(hào)，不染色為10號(hào)［圖4-1(a)］；b.以頭部為1號(hào)，按順時(shí)針?lè)较蛞来卧谟叶⒂仪爸?、右后肢、頸部、背中、尾根、左耳、左前肢、左后肢染色，分別為2-10號(hào)［圖4-1(b)］ 。,圖4-1大鼠和小鼠染色標(biāo)號(hào)法,（2）耳緣孔口法。大、小鼠常用此法

7、。在耳緣不同部位（圖4-2)用針穿孔和剪刀剪口，穿孔和剪口后，用墨黑酒精液涂抹，使其著色，不易脫失。常以右耳代表個(gè)位，左耳代表十位。孔表示1號(hào)、2號(hào)、3號(hào)和10號(hào)、20號(hào)、30號(hào)，一道口為4號(hào)、5號(hào)、6號(hào)和40號(hào)、50號(hào)、60號(hào)，二道口為7號(hào)、8號(hào)、9號(hào)和70號(hào)、80號(hào)、90號(hào)。穿孔和剪口配合，也可編1-99號(hào)，不穿不剪為100號(hào)。,,圖4-2 耳緣孔口標(biāo)號(hào)法,（3）烙印法。適用于兔以上的動(dòng)物。耳部消毒后，用刺數(shù)鉗在動(dòng)物耳上刺號(hào)，再以墨

8、黑酒精液著色。也可用鑄鐵號(hào)碼燒紅后烙在動(dòng)物體表部位，留下標(biāo)記。這種方法可較長(zhǎng)時(shí)間保留記號(hào)，適用于大動(dòng)物標(biāo)記。（4）號(hào)牌法。適用于大動(dòng)物。將金屬或塑料牌號(hào)固定在該動(dòng)物的耳上或頸下，也可掛在飼養(yǎng)動(dòng)物的籠上。,（三)抓取和固定方法 1.小鼠 捉拿方法有二種：一種辦法是用右手提起尾部，放在鼠籠蓋或其它粗糙面上，向后上方輕拉，此時(shí)小鼠前肢緊緊抓著粗糙表面，輕輕撫摸，使安靜，然后迅速用左手拇指和食指捏住小鼠雙耳和頸背部皮膚，并以小指和手

9、掌尺側(cè)夾持其尾部固定于手中(如圖4-3)；另一種抓法只用左手，先用食指和拇指抓住尾都，再用手掌尺側(cè)及小指夾住尾根，然后用拇指及食指捏住其頸部皮膚。后者適于快速捉拿給藥。,,圖4-3 小鼠抓取法 圖4-4 大鼠抓取法,2．大鼠 基本同小鼠，但大鼠牙齒很尖利，不要突然襲擊式去抓。捉拿時(shí)右手慢慢伸向抓鼠尾，盡可能向尾根部靠近，將大鼠放在粗糙面上；左手戴防護(hù)手套，抓起其頸背部盡可能多的皮膚并固定其頭部以防咬傷

10、(如圖4-4)。也可將大鼠固定在固定器。注意捉拿時(shí)勿用劇烈動(dòng)作激怒之。3．豚鼠 以拇指和中指從豚鼠背部繞到腹下，另一只平托其臀部(如圖4-5)。體重小時(shí)可用一只手捉拿，體重大時(shí)宜用雙手。,4．家兔 用右手大把抓住頸背部皮膚，輕輕提起，左手立即托住家兔的臀部或腹部，使其重量移向左手(圖4-6)，這樣既不傷害家兔，也避免兔抓傷人。捉家兔切忌只抓兩耳。,圖4-5 豚鼠抓取法 圖4-6 家

11、兔抓取法,（四)染毒方法 1．大、小鼠灌胃法： 使用lmL注射器和灌胃針，用左手拇指和食指捏住大、小鼠兩耳及頭后皮膚，其余手指將大鼠或小鼠的背部皮膚和尾巴壓在手掌間，使其軀干垂直，腹部朝內(nèi)，頭部向上，略有一個(gè)傾斜度，固定好后，右手持注射器，將針頭由動(dòng)物口角插入口腔，避開(kāi)牙齒，再?gòu)纳嗝嫜匮屎蟊陧樦萄蕜?dòng)作徐徐滑入食道下端，遇有阻力時(shí)，可輕輕上下左右滑動(dòng)，一旦感覺(jué)阻力消失，即可滑入胃內(nèi)(如圖4-5)。灌胃針插入深度，一般小鼠3～4

12、cm，大鼠、豚鼠4～6cm。,2.小鼠腹腔注射法：左手緊握動(dòng)物，右手將注射針頭從左或右下腹部朝頭部方向插入，針頭與腹壁角度不宜太小，否則易人皮下。針頭插人不宜太深或太近上腹部，以免刺傷內(nèi)臟。(如圖4-6)3.小鼠皮下注射法：可由兩人合作，一人抓住小白鼠，另一人左手捏起背部皮膚，右手持注射器將針頭刺人背部皮下。若熟練，也可一人操作(如圖4-7)。,圖4-5 小鼠灌胃法 圖4-6小鼠腹腔注射法 圖

13、4-7小鼠皮下注射法,4.小鼠尾靜脈注射法：一人抓住小鼠，或?qū)⑿“资笾糜诠潭ㄆ鲀?nèi)，使鼠尾外露，用酒精棉球涂擦，或?qū)⑹笪步?0℃熱水中0. 5min，使血管擴(kuò)張。用左手拉住尾尖，選擇一條擴(kuò)張最明顯、距尾尖1/4處的尾靜脈，右手持帶有4號(hào)針頭的注射器刺人血管注射。如注射有阻力，且局部變白，應(yīng)拔出針后，在第一次刺點(diǎn)的上方重新進(jìn)行(如圖4-8)。5.小鼠腦室注射法：由兩人合作，一人固定好小鼠，另一人用眼科鑷提起兩耳連線中間處的皮膚，用手術(shù)剪

14、快速剪去距鑷尖0.3cm處的皮膚，暴露出顱骨。在距冠狀縫和矢狀縫各砰1.5mm左右處，先用小號(hào)鐘表改刀(固定刀頭深為2.0mm)在顱骨上穿一小孔，然后將4號(hào)或5號(hào)針頭垂直插入2-2.5mm，進(jìn)行腦室注射(如圖4-9)。,,圖4-8 小鼠尾靜脈注射法 圖4-9 小鼠腦室注射法,實(shí)訓(xùn)三 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物解剖和生物樣 本采集、制備技術(shù),一、實(shí)訓(xùn)目的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物解剖和生物樣本采集、制備是毒理學(xué)

15、研究中極為重要的基本操作技術(shù)，通過(guò)本次實(shí)訓(xùn)了解實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的內(nèi)臟形態(tài)結(jié)構(gòu)特征，掌握實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的處死方法、解剖技術(shù)，能辨認(rèn)內(nèi)部器官、正確分離組織器官；掌握血液采集方法、血清和血細(xì)胞分離技術(shù)，大鼠尿液收集方法、組織勻漿制備技術(shù)。,二、儀器和材料 (1)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 成年健康小鼠、大鼠、家兔。 (2)器材 鼠籠，大鼠代謝籠，大、小鼠固定板。手術(shù)剪，鑷子，兒科小骨鉗，塑料離心管(2～10 mL)，玻璃毛細(xì)管(內(nèi)徑l～1.5mm)，注射器(1m

16、L、2mL和5mL)，吸管，滴管，勻漿器。離心機(jī)，電子天平。 (3)試劑 抗凝劑(0.5％肝素生理鹽水溶液)；溶液(生理鹽水或某種緩沖液)。 (4)其他 碘酒，酒精棉球，干棉球，濾紙。,1.采血 (1) 鼠尾采血 (4) 腹主動(dòng)脈或股動(dòng)(靜)脈采血 (2) 眼眶靜脈叢采血 (5) 斷頭采血 (3) 摘眼球采血 (6) 心臟采血,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物安全采血量,2．血清與血細(xì)胞分離

17、 (1) 血清的制備 將全血置37℃溫箱保溫lh，4℃冰箱中保存3～4h，以3000～4000r／min離心15min，取上清液低溫保存?zhèn)溆谩Ｑ宄实S色，如呈淡紅色或紅色，表明有溶血，可能影響許多指標(biāo)的測(cè)定，一般應(yīng)廢棄。 (2) 血細(xì)胞分離 將血液采集在經(jīng)抗凝劑處理的容器中，混勻，2000r／min離心20min，小心吸出血漿。血漿與紅細(xì)胞之間有一薄層白細(xì)胞，需要時(shí)小心吸出置另一離心管中，不需要時(shí)可棄去。離心管中的沉

18、淀為紅細(xì)胞，加入等體積生理鹽水，輕輕混勻，使紅細(xì)胞懸浮，再次離心，棄上清液。如此重復(fù)3次，直至上清液無(wú)色透明為止，即獲得紅細(xì)胞。白細(xì)胞可依同法洗滌處理。,3．尿液收集 (1) 代謝籠法 適用于大、小鼠，尿液通過(guò)代謝籠的大小便分離漏斗與糞便分開(kāi)。因大、小鼠尿量較少，操作中有損失和蒸發(fā)可造成較大的誤差，故一般要采集5h以上的尿液，取平均值。 (2) 反射排尿法 適用于小鼠，提起小鼠，可反射性排尿。,4．實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的處死方法

19、 (1) 頸椎脫臼法： 多用于小鼠。 (2) 空氣栓塞法：多用于兔、犬、猴等大動(dòng)物。 (3) 斷頭法：用于大、小鼠、琢鼠。 (4) 急性放血法：用于大鼠、小鼠。 (5) 擊打法：適用于較小的動(dòng)物。 (6) 化學(xué)藥物致死法：適用于各種動(dòng)物。 (8) 其他：電擊法、槍擊法、微波法等。,,5.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的大體解剖 在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處死后應(yīng)立即解剖，越早越好。小鼠仰放在解剖盤上，用大頭針固定住四肢，提起生殖器前方的皮膚，用剪子剪一小口

20、，沿腹中線剪到頜下，把皮膚向兩邊分離。再剪開(kāi)下腹部的肌肉，也沿中線剪開(kāi)肌肉到胸骨下緣，向左側(cè)剪斷肋骨下端后，向前上方剪，直到斷開(kāi)左邊鎖骨。剪時(shí)注意刀尖稍向上挑以免傷及內(nèi)臟。右側(cè)也同樣處理后就可以揭去胸部前壁，這樣就顯示出其內(nèi)部器官自然排列位置。將肝臟和胃向后推可見(jiàn)橫膈，隔開(kāi)胸腔和腹腔，中央為結(jié)締組織的中央腱，其他部分為膈肌，為哺乳類所特有。觀察心臟跳動(dòng)情況以及腸蠕動(dòng)的情況；觀察有關(guān)臟器的外形和表面情況、顏色、邊界和大小、質(zhì)地、切面。

21、 依次完整的取出①腹腔臟器；②胸腔臟器；③腎臟和腎上腺；④泌尿器官和生殖器官；⑤顱腔臟器并對(duì)指定的臟器稱重，并計(jì)算臟器系數(shù)。,6. 組織病理學(xué)檢查常用部位有心、肝、脾、肺、腎、腦、胸腺、睪丸、腸等。對(duì)指定的器官或組織用鋒利的刀剪取材，應(yīng)統(tǒng)一取材部位。組織塊一般在10倍體積的10％福爾馬林中固定，此后常規(guī)制片(組織石蠟包埋、切片、HE染色)。應(yīng)詳細(xì)記錄顯微鏡下觀察到的病變，并做出病理診斷。必要時(shí)，請(qǐng)其他的病理學(xué)家對(duì)有疑問(wèn)的或有爭(zhēng)

22、論的發(fā)現(xiàn)進(jìn)行復(fù)查。利用特殊染色、組織化學(xué)及電子顯微鏡技術(shù)研究毒作用機(jī)制。,7.組織勻漿的制備 (1) 動(dòng)物處死 應(yīng)根據(jù)試驗(yàn)要求選擇合適的方法，如制備肺組織勻漿時(shí)不能用斷頭法處死，因易引起肺淤血(2) 臟器制備 動(dòng)物處死后快速取出所需完整臟器，迅速置冰浴中，用冷生理鹽水洗去血污，必要時(shí)用冷生理鹽水灌流以除去血液。剝?nèi)ヅK器外膜，用濾紙吸干臟器表面水分，稱重、定位留取所需組織備用或置冰箱(或液氮)中凍結(jié)保存。(3) 勻漿制備 定量

23、稱取臟器、剪碎，置勻漿機(jī)中，按設(shè)計(jì)要求加入一定量比例的溶液(生理鹽水、緩沖液、有機(jī)溶劑等)，在一定轉(zhuǎn)速下研磨一定時(shí)間，有時(shí)需在冰浴中研磨，如制備肝勻漿S9上清液或分離細(xì)胞組分，全部操作均應(yīng)在低溫(0～10℃)下進(jìn)行,,四、實(shí)訓(xùn)結(jié)果(1) 數(shù)據(jù)記錄，如下表所示，并計(jì)算臟體比（如肝／體比、腎／體比、脾／體比等)。(2) 器官顏色和形態(tài)描述。,實(shí)訓(xùn)四 小鼠急性毒性試驗(yàn),一、實(shí)訓(xùn)目的將外源化學(xué)物經(jīng)口染毒求出LD50是毒理學(xué)研究中重要的基本

24、技術(shù)和基礎(chǔ)工作之一。通過(guò)該試驗(yàn)了解受試物的毒性大小、毒性特點(diǎn)及安全性，掌握改良寇氏法或霍恩氏法的試驗(yàn)設(shè)計(jì)及LD50的計(jì)算方法，掌握化學(xué)毒物的急性毒性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)和評(píng)價(jià)方法。,二、實(shí)訓(xùn)原理急性毒性試驗(yàn)的原理是動(dòng)物一次或24h內(nèi)多次接觸外源化學(xué)物后，觀察急性毒性反應(yīng)及其程度，以及中毒死亡的原因及特征，了解受試動(dòng)物毒性反應(yīng)的劑量-反應(yīng)關(guān)系，求出LD50。,三、儀器和材料1．體重l8～22g小鼠。 2．灌胃針、注射器5套。3．25mL容量瓶

25、、小燒杯各5個(gè)。4．10mL及l(fā)mL刻度吸管各5個(gè)。5．飼養(yǎng)籠。6．HgCl2粉末,四、操作方法及步驟(一)改良寇氏法(Karber) 1．本次實(shí)驗(yàn)設(shè)5個(gè)劑量組(急性毒性試驗(yàn)一般設(shè)5~7個(gè)劑量組)，試驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分到五組。2．確定染毒劑量。經(jīng)預(yù)試驗(yàn)知到HgCl2的0％～l00％的致死劑量范圍為8～210mg/kg。 由r=lg-1(lgb–lga)/(n-1)，計(jì)算得r=2.27式中，r為各組劑量組公比。各

26、組劑量按等比級(jí)數(shù)遞增，則各組正式劑量確定為：8，18.2，41.3，93.8，213mg／kg。,3．配制藥液 按20mL/kg體重等容積灌胃。先從高劑量組配制，再按公比稀釋配制各組藥液(CⅤ→CⅣ→CⅢ→CⅡ→CⅠ)。那么CⅤ=213mg/kg÷20mL/kg=10.65mg/mL藥液配制： a.配制25mLCⅤ即取HgCl2266.25mg定容至25mL。將CⅤ濃度依次釋稀2.27倍。 b.配制C

27、Ⅳ，把CⅤ稀釋2.27倍。配制25mLCⅣ需CⅤ液 M==11mL4.計(jì)算每只動(dòng)物實(shí)際灌胃量。每只小鼠實(shí)際灌胃量=0.02ml/g×該鼠體重g,,5. 灌胃。灌胃前應(yīng)禁食4小時(shí)，空腹灌入，灌胃后3～4h再喂食。灌胃方法如實(shí)訓(xùn)二所述。若遇動(dòng)物掙扎，應(yīng)立即停止進(jìn)針或?qū)⑨槹纬?，絕不可進(jìn)針不順而硬向內(nèi)插，以免損傷或穿破食道或誤入氣管、肺，造成動(dòng)物立即死亡。立即死亡的，要另補(bǔ)動(dòng)物。 6．觀察記錄,表4-9 急性毒性反應(yīng)觀察記

28、錄表,7.統(tǒng)計(jì)及計(jì)算（1）LD50=lg-1[Xm-i(∑P-0.5)] 式中 Xm：最大劑量組劑量對(duì)數(shù)值；i：相鄰兩組劑量高劑量與低劑量之比的對(duì)數(shù)(相鄰兩組對(duì)數(shù)劑量的差值)；P：各組動(dòng)物死亡率，用小數(shù)表示(如果死亡率為80％應(yīng)寫

29、成0.80)；∑P：各組動(dòng)物死亡率之總和。（2）SlgLD50=i× 式中 SlgLD50：lgLD50的標(biāo)準(zhǔn)誤；p: 各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物死亡率；q:各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物存活率；n：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物組數(shù)。（3）LD50的95％可信限=1g-1(lgLD50士1.96SlgLD50) LD50的平均可信限= LD50士(LD50的95％可信限的高限-低限)／2,,五、結(jié)果分析與毒性評(píng)價(jià)

30、1.急性毒性分級(jí),對(duì)人可能致死的估計(jì)量,表4-10 外源化學(xué)物急性毒性分級(jí)（WHO）,2.急性毒性評(píng)價(jià) 外源化學(xué)物的經(jīng)口LD50 （1）大于10g/kg.bw，安全（2）大于人可能攝入量的10倍，有希望使用，應(yīng)進(jìn)入下一階段試驗(yàn)（3）在人可能攝入量10倍左右，重復(fù)試驗(yàn)（4）小于人可能攝入量的10倍，放棄不用3.確定受試物HgCl2的毒性大小和安全性,實(shí)訓(xùn)五 小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn),一、實(shí)訓(xùn)目的學(xué)習(xí)小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)

31、胞(PCE)微核測(cè)定方法，了解化學(xué)毒物對(duì)骨髓細(xì)胞染色體的損傷作用，掌握骨髓細(xì)胞微核測(cè)定的原理和操作方法。,二、實(shí)訓(xùn)原理微核是在細(xì)胞的有絲分裂后期染色體有規(guī)律地進(jìn)入子細(xì)胞形成細(xì)胞核時(shí)，仍然留在細(xì)胞質(zhì)中的染色單體或染色體的無(wú)著絲粒斷片或環(huán)。它在末期以后，單獨(dú)形成一個(gè)或幾個(gè)規(guī)則的次核，被包含在細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)而形成，由于比核小得多故稱微核。這種情況的出現(xiàn)往往是受到染色體斷裂劑作用的結(jié)果。另外，也可能在受到紡綞體毒物的作用時(shí)，主核沒(méi)有能夠形成，代

32、之以一組小核。此時(shí)小核往往比一般典型的微核稍大。,三、儀器和材料 (一)試劑 1.甲醇(分析純)。 2.冰醋酸(分析純)。 3.吉姆薩(Giemsa)儲(chǔ)備液：稱取Giemsa染料lg，逐漸加入少許甘油在研缽中研細(xì)溶解，共加入66mL，甘油混勻，于60℃溫箱中保溫90min，冷卻后再加入66mL甲醇混勻，于室溫中靜置1～2周，然后過(guò)濾，用棕色瓶貯存?zhèn)溆谩?.吉姆薩(Giemsa)應(yīng)用液取Giemsa貯備液1份，加pH6.8的

33、磷酸緩沖液9份，混勻，臨用時(shí)配制。 5.小牛血清。 6.pH6.8磷酸鹽緩沖液：取甲液49.5ml,乙液50.5 ml混勻即可。 （1）甲液(即1/15mol/L Na2 HP04)：稱取無(wú)水Na2 HP04 9.47g溶于l000mL蒸餾水中(Na2 HP04 ,若含有2、7或l2分子結(jié)晶水時(shí)，分別稱取11.87g,17.87g或23.88g)。 （2）乙液(即1/15mol/L KH2P04)：稱取K

34、H2P04 ，9.48g溶于l000mL蒸餾水中。 7. 受試毒物：環(huán)磷酰胺或絲裂霉素C,,(二)器材 手術(shù)剪，晾片架，電吹風(fēng)機(jī)，2mL注射器及針頭，載玻片及推片，定時(shí)鐘，止血鉗，顯微鏡(具油鏡頭)，細(xì)胞計(jì)數(shù)器。,四、操作方法與步驟 1.動(dòng)物選擇：常用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為大、小鼠。以小鼠用得最多，要求體重18～20g，7～12周齡。每組l0只左右。2.染毒次數(shù)與取樣時(shí)間：采用多次染毒的方案。每天染毒一次，共4d，第5天取樣

35、。這樣，僅取樣一次就能覆蓋24～72h高峰，如果高峰延遲到96h也不會(huì)漏掉。故推薦以4次染毒后取樣為常規(guī)方案。3.劑量選擇：受試物的最大劑量除因溶解度所限外，應(yīng)達(dá)最大耐受量，或以該化合物的80％LD50為最高劑量。在一般情況下，應(yīng)設(shè)4～5或更多試驗(yàn)組，劑量水平跨3個(gè)以上數(shù)量級(jí)。另設(shè)陽(yáng)性和陰性對(duì)照組。4.陽(yáng)性對(duì)照：可用環(huán)磷酰胺(50～100mg/kg)或絲裂霉素C(10mg/kg)。腹腔注射一次或二次均可。,（二）操作步驟 1

36、.染毒：按確定途徑給動(dòng)物染毒，同時(shí)做陽(yáng)性及陰性對(duì)照 2.涂片：用頸椎脫臼方法處死動(dòng)物，四肢固定于解剖板，將腹中線被毛浸濕。剖開(kāi)胸腹部，取下胸骨，剔去肌肉。將胸骨骨髓擠于有一滴小牛血清的載玻片上，推片。 3.固定：將推好晾干的標(biāo)本玻片放入染色缸中用甲醇溶液固定15min，取出晾干。 4.染色：用新鮮配制的l0％Giemsa染液(Giemsa原液l份加pH6.8的磷酸鹽緩沖液9份)染色l0～15min。沖洗后晾干。

37、 5.觀察計(jì)數(shù)：先在低倍鏡下觀察，選擇分布均勻、染色較好的區(qū)域，再在油鏡下觀察計(jì)數(shù)。PCE細(xì)胞呈灰藍(lán)色，一個(gè)細(xì)胞內(nèi)可出現(xiàn)一個(gè)或多個(gè)微核；NCE呈橘黃色，無(wú)核。微核發(fā)生率（‰）=含微核的PEC數(shù)/觀察的PEC數(shù)×1000,實(shí)訓(xùn)六 小鼠精子畸變?cè)囼?yàn),一、實(shí)訓(xùn)目的精子畸變?cè)囼?yàn)是檢測(cè)受試化學(xué)毒物能否破壞哺乳動(dòng)物精子正常形態(tài)的試驗(yàn)方法，通過(guò)本次實(shí)驗(yàn)，了解正常精子和畸變精子的形態(tài)，掌握精子畸變?cè)囼?yàn)的原理和步驟。,,二、實(shí)訓(xùn)原理

38、 引起精子畸變的原因很多，畸變的機(jī)理也無(wú)定論。其中一些理論認(rèn)為化學(xué)物質(zhì)可能導(dǎo)致精子形成的有關(guān)基因發(fā)生突變，引起精子畸變率增高。精子的成熟和正常形態(tài)發(fā)生過(guò)程受多種基因控制，當(dāng)這些基因中的任一個(gè)基因在化合物的作用下發(fā)生突變，就會(huì)導(dǎo)致精子的畸形率增高。某些特殊的染色體重排，如性-常染色體易位，是化合物誘發(fā)精子發(fā)生畸形率增高的主要機(jī)理。但是公認(rèn)精子畸形率增高，并非必然意味著是受試物誘發(fā)突變的結(jié)果，某些其他因素，如缺血、變態(tài)反應(yīng)、感染和體

39、溫增高等，亦可能導(dǎo)致精子畸形率增高。,,三、儀器和材料(一)器材手術(shù)剪刀、眼科直頭小鑷子、大鑷子、載玻片、染色缸、晾片板、擦鏡紙、干凈紗布、吸頭滴管、顯微鏡，離心機(jī)、離心管等(二)試劑生理鹽水、甲醇、1％伊紅染液。受試毒物：環(huán)磷酰胺或甲基磺酸乙酯。,四、操作方法與步驟(一)試驗(yàn)設(shè)計(jì)1.動(dòng)物選擇：一般采用6～8周齡的雄性小鼠。因其較為經(jīng)濟(jì)，而且已有許多實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在該實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)中小鼠最為敏感。每組應(yīng)保證至少有5只存活動(dòng)物。2.劑

40、量和分組：受試物至少設(shè)3個(gè)劑量組，并同時(shí)設(shè)陽(yáng)性和陰性對(duì)照組。受試物高劑量組的總劑量應(yīng)能使部分動(dòng)物死亡，然后以l/5或1/10遞減作為中、低劑量組。 陽(yáng)性對(duì)照可給予甲基磺酸乙酯60mg/kg或環(huán)磷酰胺20mg/Kg，腹腔注射，每天1次，連續(xù)5d。陰性對(duì)照使用等體積的溶劑。,(二) 操作步驟 1.染毒和處死：受試物多用腹腔注射。每天一次，連續(xù)5天給藥。一般在第一次給藥后第35天一次處死動(dòng)物，取樣制片?；蛟诮o藥后每周處死一批動(dòng)物，

41、連續(xù)進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀察，直到精子形態(tài)恢復(fù)正常。 2.制片:（1）頸椎脫臼法或摘眼球取血處死小鼠，取出兩側(cè)附辜放入盛有1ml生理鹽水的小燒杯中。（2）用眼科剪刀把附睪剪成4小塊，靜止5-10min，讓精子充分游離出來(lái)。（3）用吸管尖端吸取精子懸液 ，注意吸取時(shí)盡量避開(kāi)組織碎塊。（4）將吸取的精子懸液摘一滴于干凈的載玻片上，用吸管輕輕推片。（5）空氣干操，甲醇固定10-15分鐘，再用1％伊紅染液染色20分鐘，小心用自來(lái)水沖洗干凈，空氣干澡

42、 3.鏡檢：制好的精子涂片先在低倍鏡下找到背靜清晰，精子重疊較少的區(qū)域，然后用高倍鏡按一定順序檢查1000個(gè)完整的精子，記錄其中畸形精子數(shù)及畸形精子類型。,五、結(jié)果分析與評(píng)價(jià) 不同品系小鼠的精子畸形率本底值有較大差異，其影響因素也較多，故實(shí)驗(yàn)結(jié)果的判斷應(yīng)與相同實(shí)驗(yàn)條件下同時(shí)進(jìn)行的陰性對(duì)照組比較，且陰性對(duì)照組的精子畸形率應(yīng)與本實(shí)驗(yàn)室過(guò)去的記錄接近。而陽(yáng)性對(duì)照組精子畸形率必須顯著高于陰性對(duì)照組(P<0.01)，否則所得結(jié)果不可靠，