毒理學(xué)新技術(shù)

1、體外試驗(yàn)與生物新技術(shù)在毒理學(xué)中的應(yīng)用,分類,依據(jù)體外試驗(yàn)在決策過程中所起的作用篩選試驗(yàn)。它僅提供決策過程的最初的資料，還需要進(jìn)行更權(quán)威的試驗(yàn)，無論是整體還是體外試驗(yàn)。附加試驗(yàn)。它可為協(xié)作部門或法律部門的最終決策過程提供有用的資料，如機(jī)理的研究，但僅有它是不夠充分的。替代試驗(yàn)。它是在大量實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，使體外毒性試驗(yàn)?zāi)芴娲w動(dòng)物試驗(yàn)，以提供更多的信息。,基本原理,體外試驗(yàn)的基本原理是所觀察到的毒理學(xué)效應(yīng)均是毒物和／或反應(yīng)活性代謝產(chǎn)物

2、在敏感性細(xì)胞上或敏感細(xì)胞內(nèi)某一分子靶部位作用的結(jié)果。,體外毒性試驗(yàn)系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn),能控制環(huán)境因素可排除相互作用的系統(tǒng)如免疫系統(tǒng)、神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的影響每一劑量水平可利用大量的生物樣品，如細(xì)胞，細(xì)胞器等試驗(yàn)間的誤差較少可同時(shí)和／或反復(fù)多次取樣可做成復(fù)雜的互相作用的試驗(yàn)系統(tǒng)，如復(fù)合細(xì)胞培養(yǎng)等較為快速和經(jīng)濟(jì)需要較小量的受試化合物產(chǎn)生較小量的有毒廢物可以利用人體細(xì)胞減少整體動(dòng)物的使用,體外試驗(yàn)系統(tǒng),臟器灌流 肝臟灌流 腸灌流

3、 膈肌-膈神經(jīng)標(biāo)本 臟器切片 原代細(xì)胞培養(yǎng) 肝細(xì)胞原代培養(yǎng)巨噬細(xì)胞 淋巴細(xì)胞 腦細(xì)胞 心肌細(xì)胞 細(xì)胞培養(yǎng) 組織勻漿,亞細(xì)胞組分 細(xì)胞膜 微粒體 線粒體 酶,哺乳動(dòng)物細(xì)胞制備和培養(yǎng),體外系統(tǒng)分離的細(xì)胞包括懸浮液中的新鮮游離細(xì)胞、原代培養(yǎng)細(xì)胞、細(xì)胞株、細(xì)胞系及復(fù)合培養(yǎng)的細(xì)胞 在毒理學(xué)中以哺乳動(dòng)物細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的替代系統(tǒng)的原因 來自公眾要求減少實(shí)驗(yàn)中使用動(dòng)物數(shù)量的壓力整體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)可顯著地減少常規(guī)整體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

4、所需的高額費(fèi)用人們?cè)絹碓讲粷M意實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與人體結(jié)果之間相關(guān)性的缺乏。,體外系統(tǒng)——細(xì)胞在毒理學(xué)中應(yīng)用的優(yōu)、缺點(diǎn),優(yōu)點(diǎn) 改善效率，減少費(fèi)用 使用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物較少 僅需少量的受試物 較大程度控制細(xì)胞族的性狀 直接控制胞外基質(zhì)、化學(xué)物濃度及接觸時(shí)間 排除可能的混淆因素如激素；神經(jīng)系統(tǒng)或免疫系統(tǒng)的影響

5、 可從同一實(shí)驗(yàn)體系重復(fù)取樣缺點(diǎn) 缺少整個(gè)器官的形態(tài)學(xué)觀察 選擇性喪失整體器官特異性功能，如毒性代謝酶的喪失 缺乏可能的調(diào)節(jié)影響因素如激素，神經(jīng)系統(tǒng)或免疫系統(tǒng)， 一般為靜態(tài)系統(tǒng)，將導(dǎo)致營養(yǎng)物質(zhì)的逐漸減少和代謝終產(chǎn)物的逐漸累積。 多為短期試驗(yàn)，對(duì)亞慢性或慢性毒性的評(píng)估價(jià)值不大,毒理學(xué)研究中常用細(xì)胞,各種物種的成纖維細(xì)胞淋巴母細(xì)胞腹水

6、瘤細(xì)胞淋巴細(xì)胞角質(zhì)細(xì)胞肝 細(xì) 胞肝癌細(xì)胞腎臟髓質(zhì)和皮質(zhì)細(xì)胞,肺的各種類型細(xì)胞培養(yǎng)的背根膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)的睪丸細(xì)胞膀胱細(xì)胞心臟細(xì)胞脊髓微血管細(xì)胞脂肪細(xì)胞,細(xì)胞實(shí)驗(yàn)方法,建立正在迅速生長的細(xì)胞株，用以觀察受試物對(duì)整體細(xì)胞的一般毒作用和正在分裂組織的毒作用利用已高度分化的細(xì)胞，無論是原代培養(yǎng)或是特定的細(xì)胞株，研究受試物對(duì)已分化成熟的細(xì)胞或其功能的特殊毒作用；,細(xì)胞培養(yǎng)的基本條件,無菌條件：凈化工作室，風(fēng)淋室，傳遞窗，高效過

7、濾器，　　　　　潔凈層流罩，生物安全柜，超凈工作臺(tái)，紫外　　　　　燈，電熱干燥箱，濾器，高壓滅菌器，抗生素 細(xì)胞生長條件：純水蒸餾器，純水儀，培養(yǎng)板，培養(yǎng)瓶， 　　　　　　　CO2培養(yǎng)箱，培養(yǎng)基，血清細(xì)胞檢測(cè)條件：倒置顯微鏡，酶標(biāo)儀 ，微孔板震蕩器，高　　　　　　　速離心機(jī)，移液器 細(xì)胞保存條件：液氮罐實(shí)驗(yàn)室安全：生物實(shí)驗(yàn)室安全，P1,P2,P3實(shí)驗(yàn)室安全,風(fēng)淋室:　　風(fēng)淋室是生物潔凈室的理想配套設(shè)備，它不僅可以清除人

8、體和物品表面附著的塵埃，減少帶入潔凈室的灰塵量，而且兼有氣閘室的功能，可防止非潔凈空氣的侵入。,傳遞窗:　　該裝置是一種潔凈室的輔助設(shè)備，主要用于潔凈區(qū)與潔凈區(qū)，潔凈區(qū)與非潔凈區(qū)之間小件物品的傳遞，以減少潔凈室的開門次數(shù)，把對(duì)潔凈區(qū)的污染降低到最低程度。,超凈工作臺(tái),,超凈工作臺(tái)的工作原理是利用鼓風(fēng)機(jī)驅(qū)動(dòng)空氣，通過高效濾器除去空氣中的塵埃顆粒，使空氣得到凈化。凈化空氣徐徐通過工作臺(tái)面，使工作臺(tái)內(nèi)構(gòu)成無菌環(huán)境。,培 養(yǎng) 板,培養(yǎng)瓶,酶

9、標(biāo)儀 微孔板震蕩器,培養(yǎng)細(xì)胞生長的條件,1 細(xì)胞的營養(yǎng)需要2 細(xì)胞的生存環(huán)境 溫度: 37 ℃，O2 　CO2: 5%，CO2 +H2O ← →H2CO3 ← →H+ + HCO3- pH: 7.2-7.4 滲透壓 3 無污染 4 無毒,細(xì)胞培養(yǎng)用液的配制水：新鮮配置的三蒸水或去離子水平衡鹽溶液：無Ca2+、Mg2+的緩沖

10、液 PBS：NaCl 8.0 g KCl 0.2 g Na2HPO4.H2O 1.56 g KH2PO4 0.20 加水至

11、1000 ml,胰蛋白酶作用于與賴氨酸或精氨酸相連接的肽健，除去細(xì)胞間粘蛋白及糖蛋白，影響細(xì)胞骨架，從而使細(xì)胞分離。胰蛋白酶液濃度越高，作用越強(qiáng)，但超過一定限度會(huì)損傷細(xì)胞。胰蛋白酶是一種黃白色粉末，用無Ca2+、Mg2+的PBS緩沖液配制常用的胰蛋白酶液濃度是0.25％ 。用濾器過濾除菌。胰蛋白酶液消化時(shí)間：2-10分鐘。用含血清培養(yǎng)液終止其對(duì)細(xì)胞的消化作用,消化液：,培養(yǎng)基：,培養(yǎng)基（培養(yǎng)液）是維持體外細(xì)胞生存和生長的溶液，

12、分天然培養(yǎng)基和合成培養(yǎng)基。天然培養(yǎng)基：天然培養(yǎng)基有血清、血漿和組織提取液（如雞胚和牛胚浸液）。優(yōu)點(diǎn)：營養(yǎng)成分豐富，培養(yǎng)效果好缺點(diǎn)：來源受限。 成分復(fù)雜，影響對(duì)某些實(shí)驗(yàn)產(chǎn)物的提取和實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析。易發(fā)生支原體污染,合成培養(yǎng)基,,主要成分是氨基酸、維生素、碳水化合物、無機(jī)鹽和其它一些輔助物質(zhì)。優(yōu)點(diǎn)：標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)，組分和含量相對(duì)固定。成本低 。 缺點(diǎn)： 缺少某些成分不能完全滿足細(xì)胞生長需要。

13、　如 TC199、MEM、RPMI-1640、 DMEM等。,無血清培養(yǎng)基尚處于研究階段，難以推廣。目前，絕大多數(shù)人工合成培養(yǎng)基使用時(shí)還需添加血清。 一般說來，含5％小牛血清的培養(yǎng)基對(duì)大多數(shù)細(xì)胞可以維持細(xì)胞不死，但支持細(xì)胞生長一般需加 10％血清．,血清質(zhì)量好壞是實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵。常用血清有胎牛血潔、小牛血情、兔血清、馬血清等，其中以胎牛血清質(zhì)量最好。優(yōu)質(zhì)血清的標(biāo)準(zhǔn)：透明，淡黃色，無沉淀物，無細(xì)菌、支原體、病毒污染。血清

14、的滅活（消除補(bǔ)體活性）：56 ℃ ，30 分鐘血清的消毒：過濾除菌,抗菌素的使用： 在培養(yǎng)液配制后，培養(yǎng)液內(nèi)常加適量抗菌素，以抑制可能存在的細(xì)菌的生長。 通常是青霉素和鏈霉素聯(lián)合使用。培養(yǎng)基內(nèi)青霉素、鏈霉素最終使用濃度為每毫升100單位。 慶大霉素：每毫升100單位——方便、廣譜、穩(wěn)定。,基礎(chǔ)培養(yǎng)基 80％一95％血清

15、5％一20％碳酸氫鈉 2.0 g/L青、鏈霉素 各100單位／毫升,完全培養(yǎng)基的組成,RPMI-1640培養(yǎng)粉 1袋 碳酸氫鈉 2.0 g 青、鏈霉素 各100單位／毫升 加三蒸水 至 1000ml, 過濾除菌； 調(diào)節(jié)pH值至7.2； 加

16、血清（終濃度 10％）。,培養(yǎng)基的配制,主要培養(yǎng)基,MEM：低限量Eagle培養(yǎng)基DMEM：貼壁細(xì)胞IMDM：密度低、生長困難細(xì)胞，雜交瘤細(xì)胞RPMI1640：懸浮、腫瘤、原代、傳代等細(xì)胞199、109培養(yǎng)基：原代培養(yǎng)、難以培養(yǎng)的細(xì)胞,細(xì)胞培養(yǎng)基本技術(shù),,無菌操作技術(shù),體外培養(yǎng)細(xì)胞缺乏抗感染能力，所以防止污染是決定培養(yǎng)成功或失敗的首要條件。,【培養(yǎng)前準(zhǔn)備】 在開始實(shí)驗(yàn)前要制定好實(shí)驗(yàn)計(jì)劃和操作程序。根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求，準(zhǔn)備各

17、種所需器材和物品、清點(diǎn)無誤后將其放置操作場所(培養(yǎng)室、超凈臺(tái))內(nèi)，然后開始消毒。避免開始實(shí)驗(yàn)后，因物品不全往返拿取而增加污染機(jī)會(huì)。,【操作與消毒】 無菌培養(yǎng)室每天都要用0.2%的新潔爾滅拖洗地面—次(專用拖布)，紫外線照射消毒30-50min，超凈工作臺(tái)臺(tái)面每次實(shí)驗(yàn)前要用75％酒精擦洗。然后紫外線消毒30min。在工作臺(tái)面消毒時(shí)切勿將培養(yǎng)細(xì)胞和培養(yǎng)用液同時(shí)照射紫外線，物品不要重疊放置。移液器、廢液缸、污物盒、試管架等用75%酒精

18、擦洗后置于臺(tái)內(nèi)同時(shí)紫外線消毒。,【火焰消毒】 首先要點(diǎn)燃酒精燈。按裝吸管帽、打開或封閉瓶口等，都需在火焰近處并經(jīng)過燒灼進(jìn)行。,【操作】 進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，動(dòng)作要準(zhǔn)確敏捷，但又不必太快，以防空氣流動(dòng)。,培養(yǎng)細(xì)胞的觀察,１．肉眼觀察培養(yǎng)物顏色及混濁度２．倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長狀態(tài),細(xì)胞計(jì)數(shù),培養(yǎng)的細(xì)胞在一般條件下要求有一定的密度才能生長良好，所以要進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)結(jié)果以每毫升細(xì)胞數(shù)表示。細(xì)胞計(jì)數(shù)的原理和方法與血細(xì)胞計(jì)數(shù)相同。血細(xì)

19、胞計(jì)數(shù)器：手工計(jì)數(shù)細(xì)胞,細(xì)胞計(jì)數(shù)：　 1、將計(jì)數(shù)板及蓋片擦拭干凈，將蓋片蓋在計(jì)數(shù)板上?！?2、吸少許細(xì)胞懸液，滴加在蓋片邊緣，使懸液充滿蓋片和計(jì)數(shù)板之間。　 3、靜置3分鐘。　 4、鏡下觀察，計(jì)算計(jì)數(shù)板四大格細(xì)胞總數(shù)，壓線細(xì)胞只計(jì)左側(cè)和上方的。然后按下式計(jì)算：　　細(xì)胞數(shù)/ml＝4大格細(xì)胞總數(shù)/ 4×10000　　注意：若兩個(gè)以上的細(xì)胞團(tuán)，按單個(gè)細(xì)胞計(jì)算，若細(xì)胞團(tuán)占10%以上，需重新制備細(xì)胞懸液。,根據(jù)細(xì)胞生長的恃點(diǎn)

20、，傳代方法有3種：1懸浮生長細(xì)胞傳代離心法傳代：離心（1000轉(zhuǎn)/分）去上清，沉淀物加新培養(yǎng)液后再混勻傳代。 直接傳代法：懸浮細(xì)胞沉淀在瓶壁時(shí)，將上清培養(yǎng)液去除l／2一2／3，然后用吸管直接吹打形成細(xì)胞懸液再傳代。,細(xì)胞傳代方法,2．半懸浮生長細(xì)胞傳代（Hela細(xì)胞） 此類細(xì)胞部分呈現(xiàn)貼壁生長現(xiàn)象，但貼壁不牢，可用直接吹打法使細(xì)胞從瓶壁脫落下來，進(jìn)行傳代。3．貼壁生長細(xì)胞傳代 采用酶消化法傳代。常用的消化液有0.25

21、％的胰蛋白酶液。,總細(xì)胞中活細(xì)胞所占的百分比叫做細(xì)胞活力檢測(cè)的細(xì)胞：組織分離的細(xì)胞復(fù)蘇后的細(xì)胞,培養(yǎng)細(xì)胞活力測(cè)定,1．臺(tái)盼藍(lán)法活細(xì)胞不被染色，死細(xì)胞染成藍(lán)色；方法： 1、將細(xì)胞懸液以0.5ml加入試管中； 2、加入0.5ml 0.4%臺(tái)盼蘭染液，染色2一3分鐘； 3、鏡檢計(jì)細(xì)胞活力。 死細(xì)胞深蘭色，活細(xì)胞呈無色透明狀。,2．四唑鹽（MTT）比色法四唑鹽（MTT）商品名為噻唑藍(lán)；原理：活細(xì)胞中脫氫酶能

22、將四唑鹽還原成不溶干水的藍(lán)紫色產(chǎn)物，而死細(xì)胞沒有這種功能。二甲亞砜（DMSO）能溶解藍(lán)紫色，溶液顏色深淺與所含的formazan量成正比。酶標(biāo)儀測(cè)定OD值。,,,細(xì)胞凍存和復(fù)蘇,細(xì)胞低溫冷凍貯存是細(xì)胞室的常規(guī)工作。凍存和復(fù)蘇的原則：慢凍快融慢凍程序： 將冷凍管放入紗布袋內(nèi)，通過線繩將紗布袋固定于液氮罐罐口，按每分鐘溫度下降1～2℃的速度，在40分鐘內(nèi)降至液氮表面，停30分鐘后，直接投入液氮中。常用的低溫保護(hù)劑是DMSO,細(xì)胞

23、復(fù)蘇方法,（1）從液氮中取出冷凍管，迅速投入37～38 ℃水浴中，使其融化（1分鐘左右）；　 （2）5分鐘內(nèi)用培養(yǎng)液稀釋至原體積的10倍以上；　?。?）低速離心10分鐘；　　（4）去上清，加新鮮培養(yǎng)液培養(yǎng)剛復(fù)蘇的細(xì)胞。,培養(yǎng)細(xì)胞的生物學(xué)特征,植物輸導(dǎo)水分的細(xì)胞,哺乳類的肌肉細(xì)胞,人類脊髓神經(jīng)細(xì)胞,體外培養(yǎng)細(xì)胞的分型,（一）貼附型： 大多數(shù)培養(yǎng)細(xì)胞貼附生長，屬于貼壁依賴性細(xì)胞，大致分成以下四型：,培養(yǎng)細(xì)胞的生長和增殖過程,

24、（一）培養(yǎng)細(xì)胞生命期（Life Span of Culture Cells）　　所謂培養(yǎng)細(xì)胞生命期，是指細(xì)胞在培養(yǎng)中持續(xù)增殖和生長的時(shí)間。,1．原代培養(yǎng)期　　即從體內(nèi)取出組織接種培養(yǎng)到第一次傳代階段，一般持續(xù)1一4周。與體內(nèi)原組織在形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能活動(dòng)上相似性大。各細(xì)胞的遺傳性狀互不相同，依存性強(qiáng)，獨(dú)立生存性差。,2．傳代期：　　初代培養(yǎng)細(xì)胞一經(jīng)傳代后便改稱做細(xì)胞系。呈二倍體核型的細(xì)胞稱二倍體細(xì)胞系。為保持二倍體細(xì)胞性質(zhì)，細(xì)胞應(yīng)在

25、初代培養(yǎng)期或傳代后早期凍存。一般情況下當(dāng)傳代10～50次左右，細(xì)胞增殖逐漸緩慢，以至完全停止，細(xì)胞進(jìn)入第三期。,3．衰退期：　　生存，但增殖慢或不增殖；最后衰退凋亡。由于某種因素的影響，細(xì)胞可能發(fā)生自發(fā)轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化的標(biāo)志之一是細(xì)胞可能獲得永生性即細(xì)胞獲持久性增殖能力，這樣的細(xì)胞群體稱無限細(xì)胞系，主要發(fā)生在第二期末，或第三期初階段。細(xì)胞獲不死性后，核型大多變成異倍體。,（二）組織培養(yǎng)細(xì)胞一代生存期,所謂細(xì)胞“一代”一詞，系僅指從細(xì)胞接種

26、到分離再培養(yǎng)時(shí)的一段時(shí)間，這已成為培養(yǎng)工作中的一種習(xí)慣說法，它與細(xì)胞倍增一代非同一含義。如某一細(xì)胞系為第153代細(xì)胞，即指該細(xì)胞系已傳代153次。它與細(xì)胞世代（Generation）或倍增〔Doubling）不同；在細(xì)胞一代中，細(xì)胞能倍增3～6次。細(xì)胞傳一代后，一般要經(jīng)過以下三個(gè)階段：,2．指數(shù)增生期（Logarithmic growth Phase）：　　這是細(xì)胞增值最旺盛的階段，細(xì)胞分裂相增多。指數(shù)增生期細(xì)胞分裂相數(shù)量可作為判定細(xì)

27、胞生長旺盛與否的一個(gè)重要標(biāo)志。一般以細(xì)胞分裂指數(shù)表示，即細(xì)胞群中每1000個(gè)細(xì)胞中的分裂相數(shù)。一般細(xì)胞的分裂指數(shù)介于0.1%～0.5%，初代細(xì)胞分裂指數(shù)低，連續(xù)細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞分裂指數(shù)可高達(dá)3%～5%。,在接種細(xì)胞數(shù)量適宜情況下，指數(shù)增生期持續(xù)3～5天后，隨細(xì)胞數(shù)量不斷增多、生長空間漸趨減少、最后細(xì)胞相互接觸匯合成片。細(xì)胞相互接觸后，如培養(yǎng)的是正常細(xì)胞，由于細(xì)胞的相互接觸能抑制細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)，這種現(xiàn)象稱接觸抑制（Contact Inhibit

28、ion）。　　細(xì)胞接觸匯合成片后，雖發(fā)生接觸抑制，只要營養(yǎng)充分，細(xì)胞仍然能夠進(jìn)行增殖分裂，因此細(xì)胞數(shù)量仍在增多。但當(dāng)細(xì)胞密度進(jìn)一步增大，培養(yǎng)液中營養(yǎng)成分減少，代謝產(chǎn)物增多時(shí)，細(xì)胞因營養(yǎng)的枯竭和代謝物的影響，則發(fā)生密度抑制（Density Inhibition），導(dǎo)致細(xì)胞分裂停止。,特點(diǎn)：　　是細(xì)胞增生最活躍、活力最旺盛的階段　培養(yǎng)物中細(xì)胞數(shù)量呈指數(shù)增長,細(xì)胞群體均一　是理想的實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞。,判斷細(xì)胞生長的指標(biāo)：指數(shù)生長期內(nèi)細(xì)胞

29、分裂活動(dòng)的程度(增殖活性)可作為判斷細(xì)胞生長是否旺盛的重要指標(biāo)1.有絲分裂指數(shù)(MI):　　指培養(yǎng)物中分裂相數(shù)量占全部細(xì)胞數(shù)量的百分比，統(tǒng)計(jì)時(shí)，每瓶至少需計(jì)數(shù)1000個(gè)細(xì)胞?！∫话慵?xì)胞的MI約為0.1－0.5%；原代培養(yǎng)物的MI比繼代培養(yǎng)物低。連續(xù)細(xì)胞系和腫瘤細(xì)胞高，可達(dá)3%－5%。,判斷細(xì)胞生長的指標(biāo)：2.細(xì)胞群體倍增時(shí)間:　培養(yǎng)物中細(xì)胞數(shù)量翻倍的平均時(shí)間3.MTT法：反映細(xì)胞內(nèi)一種酶活性程度4.標(biāo)記核苷酸(3H-Td

30、R)摻入量：反映DNA,細(xì)胞生長一定階段(指數(shù)生長期一般持續(xù)3－5 d）,即可長滿培養(yǎng)器皿，相互匯合成片(鋪滿 confluence) 當(dāng)細(xì)胞相互接觸連接成片，出現(xiàn)接觸抑制，接觸抑制以后，雖然運(yùn)動(dòng)受抑制，但只要營養(yǎng)成分充足，仍可短期的分裂增殖，只有當(dāng)細(xì)胞密度增大到一定程度，細(xì)胞便不再分裂增殖。為密度依賴性細(xì)胞生長抑制當(dāng)細(xì)胞分裂停止后，細(xì)胞數(shù)量即不再增加進(jìn)入平臺(tái)期,3．停滯期（Stagnate Phase）：　　細(xì)胞數(shù)量達(dá)飽和密

31、度后，細(xì)胞遂停止增殖，進(jìn)入停滯期。此時(shí)細(xì)胞數(shù)量不再增加，故也稱平臺(tái)期（Plateau）。此時(shí)需做分離培養(yǎng)即傳代，否則細(xì)胞會(huì)中毒，發(fā)生形態(tài)改變，重則從底物脫落死亡，故傳代應(yīng)越早越好。傳代過晚（已有中毒跡象）能影響下一代細(xì)胞的機(jī)能狀態(tài)。在這種情況下，雖進(jìn)行了傳代，因細(xì)胞已受損，需要恢復(fù)，至少還要再傳1～2兩代，通過換液淘汰死細(xì)胞和使受損輕微的細(xì)胞得以恢復(fù)后，才能再用。,概述 細(xì)胞鋪滿后再1-2倍增, 進(jìn)入細(xì)胞達(dá)飽和密度, 可存活仍有

32、代謝活動(dòng)，但基本不分裂， 細(xì)胞數(shù)量維持在某一水平上，生長活動(dòng)停滯,特點(diǎn) (1)細(xì)胞數(shù)量： 細(xì)胞達(dá)飽和密度，出現(xiàn)密度抑制。 停止生長原因: 細(xì)胞數(shù)量多、生長地區(qū)占滿、營養(yǎng)消耗、培養(yǎng)液中代謝廢物積聚漸多，細(xì)胞停止生長?！　〖词菇?jīng)常更換培養(yǎng)液，細(xì)胞也會(huì)變性,從生長基質(zhì)表面脫落、死亡唯有進(jìn)行傳代方可緩解。,(2)細(xì)胞活動(dòng)小, 細(xì)胞膜的　活動(dòng)小(3)生長組分下降: 0－10%(4)及時(shí)傳代：細(xì)胞已中毒，即

33、使傳代，也會(huì)影響下一代細(xì)胞的功能狀況,?,體內(nèi)細(xì)胞生長在動(dòng)態(tài)平衡環(huán)境中，而組織培養(yǎng)細(xì)胞的生存環(huán)境是培養(yǎng)瓶、皿或其它容器，生存空間和營養(yǎng)是有限的。當(dāng)細(xì)胞增殖達(dá)到一定密度后，則需要分離出一部分細(xì)胞和更新營養(yǎng)液，否則將影響細(xì)胞的繼續(xù)生存，這一過程叫傳代（Passage或Subculture）。,體外培養(yǎng)細(xì)胞的種類,（一）初代培養(yǎng) 初代培養(yǎng)又稱原代培養(yǎng)，即直接從體內(nèi)取出的細(xì)胞、組織和器官進(jìn)行的第一次的培養(yǎng)物。一旦已進(jìn)行傳代培養(yǎng)（Subc

34、ulture）的細(xì)胞，便不再稱為初代培養(yǎng)，而改稱為細(xì)胞系。,（二）細(xì)胞系 初代培養(yǎng)物開始第一次傳代培養(yǎng)后的細(xì)胞，即稱之為細(xì)胞系。如細(xì)胞系的生存期有限，則稱之為有限細(xì)胞系（Finite Cell Line）；已獲無限繁殖能力能持續(xù)生存的細(xì)胞系，稱連續(xù)細(xì)胞系或無限細(xì)胞系（Infinite Cell Line）。無限細(xì)胞系大多已發(fā)生異倍化，具異倍體核型，有的可能已成為惡性細(xì)胞，因此本質(zhì)上已是發(fā)生轉(zhuǎn)化的細(xì)胞系。無限細(xì)胞系有的只有永生性（

35、或不死性），但仍保留接觸抑制和無異體接種致癌性；有的不僅有永生性，異體接種也有致瘤性，說明已惡性化。,（三）細(xì)胞株  從一個(gè)經(jīng)過生物學(xué)鑒定的細(xì)胞系用單細(xì)胞分離培養(yǎng)或通過篩選的方法，由單細(xì)胞增殖形成的細(xì)胞群，稱細(xì)胞株。再由原細(xì)胞株進(jìn)一步分離培養(yǎng)出與原株性狀不同的細(xì)胞群，亦可稱之為亞株（Substrain）,（四）二倍體細(xì)胞 細(xì)胞群染色體數(shù)目具有與原供體二倍細(xì)胞染色體數(shù)相同或基本相同（2n細(xì)胞占75％或80％以上）的細(xì)胞

36、群，稱二倍體細(xì)胞培養(yǎng)。如僅數(shù)目相同，而核型不同的即染色體形態(tài)有改變者為假二倍體。二倍體細(xì)胞在正常情況下具有限生命期，故屬有限細(xì)胞系。但隨供體年齡和組織細(xì)胞的不同，二倍體細(xì)胞的壽命長短各異。人胚肺成纖維細(xì)胞可傳50代土10代，人胚腎只有8～10代，人胚神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞15～30代。由不同年齡供體取材建立的二倍體細(xì)胞系可供研究衰老之用。為保持二倍體細(xì)胞能長期被利用，一般在初代或2～5代即大量凍存作為原種（Stook Cells），用時(shí)再進(jìn)行繁殖

37、，用后再繼續(xù)凍存，可供長期使用或延緩細(xì)胞的衰老。,（五）遺傳缺陷細(xì)胞 從有先天遺傳缺陷者取材（主要為成纖維細(xì)胞）培養(yǎng)的細(xì)胞，或用人工方法誘發(fā)突變的細(xì)胞，都屬遺傳缺欠細(xì)胞。這類細(xì)胞可能具有二倍體核型，也可呈異倍體。,（六）腫瘤細(xì)胞系或株 這是現(xiàn)有細(xì)胞系中最多的一類，我國已建細(xì)胞系主要為這類細(xì)胞。腫瘤細(xì)胞系多由癌瘤建成，多呈類上皮型細(xì)胞，常已傳幾十代或百代以上，并具有不死性和異體接種致瘤性。,細(xì)胞系或細(xì)胞株的命名,HeLa：

38、為供體患者的姓名（來源于宮頸癌）CHO：中國地鼠卵巢細(xì)胞（Chinese Hamster Ovary）宮-743：宮頸癌上皮細(xì)胞，1974年3月建立NIH3T3：美國國立衛(wèi)生研究院（National Institute of Health）建立；每3天傳代，每次接種3×105細(xì)胞／毫升。,基本技術(shù),儀器與設(shè)備 1. 培養(yǎng)箱 2. 冰箱和冷柜 冰箱(4℃) ，冷柜(—20℃)3. 顯微鏡 ，相差顯微鏡或熒光顯微鏡

39、，并附有照相裝置或攝影裝置。 4. 超凈工作臺(tái) 5.電熱干燥箱消毒 器皿的清洗可用超聲波洗滌器。6. 培養(yǎng)器皿 ；①多孔培養(yǎng)板，其規(guī)格有4孔、6孔、24孔及96孔，它體積小，適于少量細(xì)胞或單個(gè)細(xì)胞克隆的生長；②培養(yǎng)皿，③培養(yǎng)瓶，；④其它：凍存細(xì)胞的塑料安瓿及微量加樣器頭，。 ①吸管，它包括刻度吸管和移液管，常用規(guī)格有l(wèi)0ml，5ml和lml；②玻璃瓶， ③離心管， 7. 液氮貯存器 8. 水純化裝置 但

40、是，在細(xì)胞培養(yǎng)中，不宜使用去離子純水，因其不能有效地去除有機(jī)物。 9. 濾過消毒裝置,三、培養(yǎng)細(xì)胞的鑒定,目的：觀察培養(yǎng)有無變化，以決定是否終止培養(yǎng)，并從冷凍貯存的樣品重新建立新的培養(yǎng)細(xì)胞；培養(yǎng)條件(如培養(yǎng)液)變化，對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞的影響。鑒定污染鑒定生存指標(biāo)細(xì)胞性質(zhì)(如細(xì)胞形態(tài)、生長特性、染色體數(shù)目及結(jié)構(gòu)等)。,污染鑒定,細(xì)胞培養(yǎng)中常見的污染有真菌、細(xì)菌和支原體等，此外有化學(xué)物和非同一種細(xì)胞的污染。污染表現(xiàn)：細(xì)胞培養(yǎng)可明顯

41、地改變生長特性，引起pH變化和生長遲緩培養(yǎng)液表面起泡或起膜，培養(yǎng)液中的絮狀物及細(xì)胞生長表面的斑點(diǎn)，搖動(dòng)培養(yǎng)器皿可消失。,肉眼見不到的污染可影響細(xì)胞的代謝。,細(xì)胞特性鑒定,1. 形態(tài)學(xué)檢查：評(píng)價(jià)細(xì)胞正常與否的最簡單方法是形態(tài)學(xué)檢查 ?！俺衫w維樣”“上皮樣 2.生長特性的檢查主要通過測(cè)定更換培養(yǎng)液的時(shí)間和傳代的時(shí)間來完成 接種效率=小于30表示生長不正常 3.其它檢查 除上述指標(biāo)外，在細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，可進(jìn)行染色體分析，包括

42、染色體的數(shù)目和結(jié)構(gòu)以及DNA、RNA和蛋白質(zhì)的含量測(cè)定，來判斷培養(yǎng)細(xì)胞的特性。,,細(xì)胞培養(yǎng)在食品毒理學(xué)中應(yīng)用,一般毒性：主要為急性細(xì)胞毒性 器官特異性毒性：利用有代表性細(xì)胞類型如肝細(xì)胞、腎近曲小管細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞及心肌細(xì)胞等： 毒作用機(jī)理 生物轉(zhuǎn)化、毒性代謝產(chǎn)物的形成 遺傳毒性，如程序外DNA合成測(cè)定 繁殖毒性 聯(lián)合毒性 不同物種間的比較毒性 光敏

43、毒性,毒性指標(biāo)的選擇,依據(jù)不同的試驗(yàn)?zāi)康暮驮囼?yàn)條件，可選擇不同的觀察指標(biāo)。下列指標(biāo)在毒理學(xué)中經(jīng)常采用： (1) IC50：即經(jīng)3天培養(yǎng)后，引起生長速率減至對(duì)照組一半時(shí)所需受試物的濃度生長速率可用蛋白總濃度來表示，可用于細(xì)胞毒性的常規(guī)篩檢。此外，前述評(píng)價(jià)細(xì)胞特性的指標(biāo)，如形態(tài)學(xué)和接種效率等，均可采用。 (2) 細(xì)胞膜損傷：可選擇臺(tái)盼藍(lán)攝取、胞漿酶漏出、Ca2+的釋放以及鈣泵的變化等指標(biāo)來評(píng)價(jià)細(xì)胞膜的損傷。 (3)

44、大分子物質(zhì)合成與降解的改變：可選用[14C]亮氨酸蛋白試驗(yàn)和[3H]尿嘧啶參入RNA試驗(yàn)等指標(biāo)，以判斷受試物對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞的大分子合成與降解的有無作用。 (4) 代謝能力：除可選擇ATP濃度、NADP／NADPH比、谷胱甘肽含量、氧消耗量等指標(biāo)外，還有毒物代謝酶的活性、細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化作用及[14C]-葡萄糖氧化代謝成14CO2的速率，均可反映出細(xì)胞的代謝能力。 (5) 形態(tài)學(xué)觀察：通過光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡觀察，可

45、了解受試物對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)改變情況。,毒理學(xué)中應(yīng)用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)時(shí)應(yīng)注意的幾個(gè)問題,1. 細(xì)胞類型的選擇 細(xì)胞類型的選擇取決于實(shí)驗(yàn)的目的。一般性篩選系列化合物的一般毒性時(shí)，應(yīng)選擇生長迅速且易于處理的細(xì)胞系。機(jī)理研究多不用細(xì)胞系，因?yàn)榕囵B(yǎng)的細(xì)胞會(huì)逐漸喪失許多功能，如細(xì)胞色素P-450的活性。 細(xì)胞培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)之一是可選擇來源于人體的組織細(xì)胞，可減少試驗(yàn)結(jié)果的物種差異。成纖維樣細(xì)胞和上皮樣細(xì)胞均可選用。常用的細(xì)胞系有CH

46、O、V79、Hela、BHR及L929等。,2. 代謝活化,細(xì)胞經(jīng)8-24h培養(yǎng)后，細(xì)胞色素P-450活性將迅速下降。而在CHO細(xì)胞系中，涉及代謝活化的酶活性下降。所以，培養(yǎng)細(xì)胞對(duì)需代謝活化的化學(xué)物不能夠敏感。 解決方法，一是加S9。 S9需要NADPH才具有代謝活化作用，故在培養(yǎng)液中應(yīng)加有NADPH生成系統(tǒng)(葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、葡萄糖-6-磷酸和NADP)。與原代肝細(xì)胞復(fù)合培養(yǎng)。與原代肝細(xì)胞進(jìn)行復(fù)合培養(yǎng)時(shí)也可采用其它不同的

47、細(xì)胞系，如V79、中國地鼠肺成纖維細(xì)胞和人成纖維細(xì)胞。,3. 受試物的給予,許多受試物由于水溶性較低，在加入培養(yǎng)液前，常需溶于有機(jī)溶劑，有機(jī)溶劑對(duì)細(xì)胞有損害作用，故應(yīng)限制有機(jī)溶劑濃度在1％以下。在試驗(yàn)中可設(shè)立適當(dāng)?shù)挠袡C(jī)溶劑對(duì)照和培養(yǎng)液對(duì)照。,4.設(shè)立陽性對(duì)照組,實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)的重現(xiàn)性應(yīng)該用陽性對(duì)照物來檢查。陽性對(duì)照物指采用經(jīng)過研究或公認(rèn)有特定作用的化學(xué)物。,亞細(xì)胞組分制備及其檢測(cè)方法,微粒體的制備肝微粒體制備肝外組織微粒體的制備 線粒

48、體的制備亞線粒體顆粒的制備,設(shè)備,設(shè)備勻漿器離心機(jī)：低溫高速離心機(jī)，最大轉(zhuǎn)速為18 000～24000rpm，超速離心機(jī)，最大轉(zhuǎn)速為50000～75000rpm。 勻漿介質(zhì)和緩沖液最常用的勻漿介質(zhì)為等滲的蔗糖(0.25mol／L)和氯化鉀(0.154mol／L) 生物樣品 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物如大鼠、小鼠、金黃地鼠應(yīng)迅速處死，常用的方法是斷頭處死。應(yīng)避免使用麻醉劑，如乙醚、巴比妥類藥物，它們將影響毒物代謝酶的活力。,肝微粒

49、體制備,,,,,,,,,肝勻槳,離心，10000g 20 min,上清液 沉淀,離心，10500g 1h,沉淀 （微粒體） 上清液棄去,線粒體的制備,,,,,,,,,肝勻槳,離心，460g 10 min,上清液 沉淀(包括

50、細(xì)胞核，紅細(xì)胞,離心，12500g 10 min 及大的細(xì)胞碎片),沉淀 （含有線粒體） 上清液 棄去,整個(gè)制備過程應(yīng)在1h內(nèi)完成,,,,,,細(xì)胞碎片和紅細(xì)胞,,大量完整的線粒體和一些溶酶體,,一些破的線粒體和微粒體,,細(xì)胞程序性死亡及其檢測(cè)方法,細(xì)胞程序性死亡(programmed cell death，PCD)是一種與遺傳機(jī)制有關(guān)的、主動(dòng)的自

51、發(fā)性死亡方式，并在形態(tài)和生化上出現(xiàn)一系列特征表現(xiàn)。具有這些特征表現(xiàn)的細(xì)胞稱為細(xì)胞凋亡(apoptosis)。細(xì)胞凋亡：而細(xì)胞凋亡的特征表現(xiàn)是胞內(nèi)水分丟失，胞漿濃縮，胞膜結(jié)構(gòu)完好，細(xì)胞核濃縮聚集于核膜邊緣，形成新月形。到晚期，細(xì)胞核碎裂成小片，胞漿分割，形成由細(xì)胞膜所包繞的含有核碎片的小體，稱為凋亡小體(apoptotic body)。細(xì)胞壞死(necrosis) ：壞死是指體內(nèi)、外致?lián)p傷因素作用達(dá)到一定強(qiáng)度、持續(xù)一定時(shí)間后，所導(dǎo)

52、致的細(xì)胞死亡，它表現(xiàn)為細(xì)胞及細(xì)胞器腫脹、碎裂和溶解等。,細(xì)胞程序性死亡的檢測(cè)方法,1. 形態(tài)學(xué)觀察法 主要依靠光學(xué)顯微鏡或電子顯微鏡觀察細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)特點(diǎn)。觀察材料可以是石蠟切片、冰凍切片或細(xì)胞涂片。形態(tài)學(xué)觀察可用HE染色或熒光染料PI、DAPI等染色。,normal,,,掃描電鏡,,透射電鏡觀察,,電泳檢測(cè)法,原理是在細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，由于內(nèi)源性核苷酸酶的激活，DNA被有規(guī)律地切割成約180bp或其倍體的雙鏈DNA片段，在凝膠電

53、泳上可形成梯帶，即具有凋亡的特征DNA梯帶(DNAladder)。,,，,單細(xì)胞凝膠電泳,將細(xì)胞包埋于低熔點(diǎn)瓊脂糖內(nèi)，置于堿性裂解液中，使細(xì)胞裂解后，瓊脂糖凝膠電泳，經(jīng)EB染色，觀察細(xì)胞DNA的斷裂情況。,末端轉(zhuǎn)移標(biāo)記法,末端轉(zhuǎn)移標(biāo)記技術(shù)是利用在發(fā)生凋亡時(shí)，DNA鏈被激活的內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶切割成許多180bp左右的雙鏈DNA片段。這些片斷均含有3?-OH末端，在末端轉(zhuǎn)換酶或DNA多聚酶，(TdT酶)作用下，加入已標(biāo)記的核苷酸或核苷酸混

54、合物，再經(jīng)過酶顯色或用熒光抗體使之顯示出來。,細(xì)胞分析儀檢測(cè)法,常用的細(xì)胞分析儀有兩類，流式細(xì)胞分析儀，可對(duì)單個(gè)細(xì)胞懸液中的單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。借助細(xì)胞標(biāo)記技術(shù)和計(jì)算機(jī)分析技術(shù)，可快速檢出發(fā)生凋亡的細(xì)胞。其原理是在正常增殖狀態(tài)的細(xì)胞，處于不同周期時(shí)相，即G0／Gl，S1，G2／M期，其DNA含量分布在2n～4n之間；。 細(xì)胞形態(tài)分析儀，可對(duì)載玻片上單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。,,二、細(xì)胞凋亡相關(guān)基因,現(xiàn)已報(bào)道，有25個(gè)癌基因與細(xì)胞凋亡有關(guān)。

55、細(xì)胞凋亡相關(guān)基因大致可分為兩大類，即凋亡促進(jìn)（apoptosis on）基因和凋亡抑制（apoptosis off ）基因。它們分別起著促進(jìn)凋亡和抑制凋亡的作用，彼此之間還存在一定的相互關(guān)聯(lián)。1．凋亡抑制基因凋亡抑制基因包括bcl-2、ced-9、bcl-X，其中最主要也是當(dāng)前研究最多的是bcl-2，bcl-2是癌基因的一種，在人體多種形態(tài)的腫瘤中過度表達(dá)，可抑制由多種剌激包括化療和放療引起的細(xì)胞凋亡。bcl-2常在淋巴細(xì)胞系統(tǒng)和神

56、經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá)，抑制該部位的細(xì)胞凋亡。淋巴性白血病細(xì)胞中bcl-2也是過度表達(dá)的。,,2．凋亡促進(jìn)基因凋亡促進(jìn)基因有ced-3,4、p53、ICE、Bax、bcl-Xs、TGFβ等。其中ced-3，4是在線蟲索中發(fā)現(xiàn)的，而p53、ICE等存在于哺乳動(dòng)物中。p53為腫瘤的抑制基因，分為兩型，一型是使細(xì)胞周期停止在GI期，抑制細(xì)胞繁殖的野生型；另一型是具有突變能力的變異型。野生型p53可誘導(dǎo)易感細(xì)胞發(fā)生凋亡。白介素1β轉(zhuǎn)換酶（inter

57、lukin 1-β-converting enzyme, ICE）,與線蟲細(xì)胞凋亡相關(guān)基因ced-3有較高的同源性，具有直接誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用。c-myc是典型的原癌基因，在許多腫瘤中它有多種失活形式。c-myc的表達(dá)驅(qū)動(dòng)細(xì)胞凋亡，這與細(xì)胞所處的條件有關(guān),凋亡基因之間的相互作用,bcl-2能妨礙依賴p53的凋亡，但不影響依賴p53的生長停滯，可是將bcl-2與c-myc共表達(dá)時(shí)，這兩者都被阻斷。一個(gè)主要顯性癌基因c-myc與一個(gè)抗凋

58、亡基因bcl-2的協(xié)同作用會(huì)導(dǎo)致腫瘤向惡性表型進(jìn)展，并對(duì)腫瘤治療的抗性增加，而p53和bcl-2間的相互拮抗作用則有利于抗腫瘤治療。,凋亡細(xì)胞特有的生化改變,(1)Ca2+活化胞漿蛋白酶，稱為ICE已發(fā)現(xiàn)至少10種，參與凋亡的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，例如caspase-3，稱為CPP32/YAMA/apopain，可降解DNA修復(fù)有關(guān)的酶PARP［poly(ADP-ribose)聚合酶］。(2)細(xì)胞內(nèi)Ca2+增高，活化核酸內(nèi)切酶，切割染色體以核小體

59、DNA(約200 bp)為單位的DNA片段，此切割是非隨機(jī)的，它與壞死時(shí)DNA隨機(jī)降解有明顯的不同。(3)與胞漿蛋白質(zhì)交聯(lián)有關(guān)的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶活性的增加。(4)細(xì)胞膜內(nèi)層的磷脂酰絲氨酸外翻至膜外，從而有利于巨噬細(xì)胞的識(shí)別和吞噬。,定量檢測(cè)細(xì)胞凋亡的方法,1.DNA片段化的定量。包括分離胞漿片段化DNA的定量和以流式細(xì)胞儀(FACS)分析細(xì)胞的亞二倍體峰。2.抗組蛋白抗體經(jīng)Elisa測(cè)定胞漿核小體。3.PARP的Western印跡法

60、測(cè)定凋亡的早期事件。113 000的PARP降解為89 000及24 000的片段，這是凋亡蛋白酶caspase-3/CPP 32的作用所致。4.膜聯(lián)蛋白-5(annexin-5)熒光法。以FACS直接分析凋亡與壞死，這是因膜內(nèi)的磷脂酰絲氨酸在凋亡時(shí)轉(zhuǎn)至膜外而被標(biāo)記。5.原位細(xì)胞死亡測(cè)定(TdT-mediated dUTP-Xnick end labeling, TUNEL)。這是基于核酸內(nèi)切酶將DNA鏈切出缺口的原理。,（二）細(xì)胞

61、周期,細(xì)胞周期（細(xì)胞分裂周期），是指一個(gè)細(xì)胞經(jīng)生長、分裂而增殖成兩個(gè)所經(jīng)歷的全過程，G0=靜止期G1=可變的DNA合成前期， (12h~幾天)S=DNA合成期(2~4h)G2=DNA合成后期， (2~4h)M=分裂期(1~2h),,細(xì)胞周期特異性藥物是指那些僅對(duì)惡性腫瘤細(xì)胞增殖周期中．某一期細(xì)胞有殺滅作用的藥物。例如：羥基脲、阿糖胞苷、巰嘌呤、甲氨喋呤等，能干擾DNA的合成，對(duì)惡性腫瘤細(xì)胞的S(DNA合成)期有特異性殺傷作用；

62、長春新堿和長春花堿，則可特異地殺傷處于M(有絲分裂)期的細(xì)胞。,,細(xì)胞周期非特異性藥物是指對(duì)處于細(xì)胞增殖周期中的各期(G1、S、G2、M)或是休止期的細(xì)胞(G0)均具有殺滅作用的藥物。它們大多能與細(xì)胞中的DNA結(jié)合，阻斷其復(fù)制。從而表現(xiàn)其殺傷細(xì)胞的作用?？鼓[瘤藥物中的烷化劑及阿霉素、博萊霉素等抗癌抗生素即屬于此類藥物。,（三）端粒與腫瘤,端粒酶在正常體細(xì)胞中無活性或檢測(cè)不出其活性，而在大多數(shù)腫瘤細(xì)胞中活性高，且其功能是添加端粒重復(fù)序列至

63、DNA末端阻止端粒隨細(xì)胞分裂而縮短，起著穩(wěn)定DNA的作用。因此，許多學(xué)者推測(cè)端粒酶可能是腫瘤治療的最佳靶點(diǎn)之一。FENGJL等（1995），用端粒酶RNA組份的反義核苷酸轉(zhuǎn)導(dǎo)入HeLa細(xì)胞中后，細(xì)胞端粒酶活性喪失，端粒也隨著細(xì)胞分裂而逐漸變短，經(jīng)20－26個(gè)倍增時(shí)間，細(xì)胞發(fā)生衰老死亡。,1.端粒酶的生化特性,端粒酶：蛋白——起催化端粒合成的作用， RNA——作為端粒合成的內(nèi)模板端粒酶的功能即為添加端