定向分析毒理學(xué)方法的建立、優(yōu)化及其在環(huán)境毒理學(xué)的初步應(yīng)用.pdf

1、毒理學(xué)，尤其是環(huán)境毒理學(xué)，其主要研究任務(wù)是探索蓄積于生物體內(nèi)的污染物及其對生物體的后續(xù)影響。在大多數(shù)環(huán)境毒理學(xué)研究中，建立生物體內(nèi)污染物暴露水平與生物/分子響應(yīng)之間的關(guān)系是最重要的目標(biāo)之一。為實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)，人們通常要測定污染物及其響應(yīng)（常定義為生物標(biāo)志物）的濃度水平。但在大多數(shù)研究中，二者是分開進(jìn)行測定的，因而需要耗費(fèi)大量的時(shí)間、金錢和勞力。此外，某些生物標(biāo)志物分析方法的局限性還限制了對生物標(biāo)志物的測定。如用于測定蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物的免疫

2、分析方法，嚴(yán)重依賴于相應(yīng)的抗體。
　　定向蛋白組學(xué)的發(fā)展使得在同一樣品中實(shí)現(xiàn)對污染物濃度及蛋白生物標(biāo)志物濃度的同時(shí)測定成為了可能。定向蛋白組學(xué)是在近些年發(fā)展起來的一種對樣品中感興趣的一組目標(biāo)蛋白進(jìn)行定量分析的方法。在定向蛋白組學(xué)的實(shí)驗(yàn)中，預(yù)先被選定的蛋白首先被酶解成多肽，再被LC-MS/MS檢測。這種方法在蛋白分析中具有高靈敏度、高定量準(zhǔn)確度及高重現(xiàn)性的特點(diǎn)。在定向蛋白質(zhì)組學(xué)中，預(yù)選蛋白質(zhì)酶解所形成的目標(biāo)多肽通常用LC-MS/MS

3、（尤其是三重四級桿）進(jìn)行定量分析，而許多環(huán)境污染物最理想的定量方法也是用LC-MS/MS。因此，利用LC-MS/MS對這兩類指標(biāo)進(jìn)行同時(shí)測定在理論上是可行的。但是，目前尚未見到這方面的研究報(bào)道。
　　基于定向蛋白組學(xué)方法，建立了一種新的方法并將之命名為定向分析毒理學(xué)（targeted analytical toxicology，TAT）。該方法利用UPLC/ESI-MS/MS對生物體內(nèi)的污染物和蛋白生物標(biāo)志物進(jìn)行同時(shí)測定。首先將該

4、方法成功應(yīng)用于暴露于17α-雌二醇(EE2)的成年雄性斑馬魚體內(nèi)EE2及其誘導(dǎo)的卵黃蛋白原(VTG)的同時(shí)定量分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，EE2濃度和VTG濃度之間有顯著的正相關(guān)性(p＜0.05)。且基于生物體內(nèi)污染物的內(nèi)暴露濃度的劑量-效應(yīng)關(guān)系圖也比基于污染物的名義暴露濃度的劑量-效應(yīng)關(guān)系圖更具有可靠性。
　　隨后對TAT方法進(jìn)行了優(yōu)化。實(shí)驗(yàn)首先通過設(shè)計(jì)含有可被胰酶消化位點(diǎn)的目標(biāo)長肽來示蹤胰酶的消化效率，結(jié)果表明不同長度的含有可被胰酶消

5、化位點(diǎn)的目標(biāo)長肽在示蹤胰酶消化效率上并不存在明顯差異。同時(shí)也通過優(yōu)化前處理的方法來提高EE2的回收率。結(jié)果表明，相比3kDa前處理方法，SPE前處理能夠提高EE2回收率，從而提高方法的性能。
　　在建立并優(yōu)化了TAT方法后，將該方法初步應(yīng)用于環(huán)境毒理學(xué)研究當(dāng)中。我們選取人肺癌細(xì)胞系(A549)為研究模型，研究有機(jī)磷阻燃劑(OPFRs)對A549細(xì)胞中三個(gè)蛋白生物標(biāo)志物（白介素IL-6、腫瘤壞死因子TNF-α及腫瘤蛋白p21 ras

6、）的誘導(dǎo)情況，并利用TAT方法對暴露于OPFR/s的A549細(xì)胞中的OPFR/s和這三個(gè)蛋白質(zhì)進(jìn)行同時(shí)定量分析。實(shí)驗(yàn)通過優(yōu)化前處理方法將A549細(xì)胞單一/復(fù)合暴露于不同的有機(jī)磷阻燃劑中，盡管TAT方法能夠同時(shí)對多個(gè)有機(jī)磷阻燃劑和多個(gè)蛋白生物標(biāo)志物進(jìn)行同時(shí)定量分析，但均未檢測到IL-6、TNF-alpha及p21 ras蛋白的過度表達(dá)。與此同時(shí)，還利用ELISA方法對TAT實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。二者的數(shù)據(jù)結(jié)果表明，暴露于有機(jī)磷阻燃劑的A549