定向分析毒理學方法的建立、優(yōu)化及其在環(huán)境毒理學的初步應用.pdf

1、毒理學，尤其是環(huán)境毒理學，其主要研究任務是探索蓄積于生物體內(nèi)的污染物及其對生物體的后續(xù)影響。在大多數(shù)環(huán)境毒理學研究中，建立生物體內(nèi)污染物暴露水平與生物/分子響應之間的關(guān)系是最重要的目標之一。為實現(xiàn)這一目標，人們通常要測定污染物及其響應（常定義為生物標志物）的濃度水平。但在大多數(shù)研究中，二者是分開進行測定的，因而需要耗費大量的時間、金錢和勞力。此外，某些生物標志物分析方法的局限性還限制了對生物標志物的測定。如用于測定蛋白質(zhì)生物標志物的免疫

2、分析方法，嚴重依賴于相應的抗體。
　　定向蛋白組學的發(fā)展使得在同一樣品中實現(xiàn)對污染物濃度及蛋白生物標志物濃度的同時測定成為了可能。定向蛋白組學是在近些年發(fā)展起來的一種對樣品中感興趣的一組目標蛋白進行定量分析的方法。在定向蛋白組學的實驗中，預先被選定的蛋白首先被酶解成多肽，再被LC-MS/MS檢測。這種方法在蛋白分析中具有高靈敏度、高定量準確度及高重現(xiàn)性的特點。在定向蛋白質(zhì)組學中，預選蛋白質(zhì)酶解所形成的目標多肽通常用LC-MS/MS

3、（尤其是三重四級桿）進行定量分析，而許多環(huán)境污染物最理想的定量方法也是用LC-MS/MS。因此，利用LC-MS/MS對這兩類指標進行同時測定在理論上是可行的。但是，目前尚未見到這方面的研究報道。
　　基于定向蛋白組學方法，建立了一種新的方法并將之命名為定向分析毒理學（targeted analytical toxicology，TAT）。該方法利用UPLC/ESI-MS/MS對生物體內(nèi)的污染物和蛋白生物標志物進行同時測定。首先將該

4、方法成功應用于暴露于17α-雌二醇(EE2)的成年雄性斑馬魚體內(nèi)EE2及其誘導的卵黃蛋白原(VTG)的同時定量分析。實驗結(jié)果表明，EE2濃度和VTG濃度之間有顯著的正相關(guān)性(p＜0.05)。且基于生物體內(nèi)污染物的內(nèi)暴露濃度的劑量-效應關(guān)系圖也比基于污染物的名義暴露濃度的劑量-效應關(guān)系圖更具有可靠性。
　　隨后對TAT方法進行了優(yōu)化。實驗首先通過設計含有可被胰酶消化位點的目標長肽來示蹤胰酶的消化效率，結(jié)果表明不同長度的含有可被胰酶消

5、化位點的目標長肽在示蹤胰酶消化效率上并不存在明顯差異。同時也通過優(yōu)化前處理的方法來提高EE2的回收率。結(jié)果表明，相比3kDa前處理方法，SPE前處理能夠提高EE2回收率，從而提高方法的性能。
　　在建立并優(yōu)化了TAT方法后，將該方法初步應用于環(huán)境毒理學研究當中。我們選取人肺癌細胞系(A549)為研究模型，研究有機磷阻燃劑(OPFRs)對A549細胞中三個蛋白生物標志物（白介素IL-6、腫瘤壞死因子TNF-α及腫瘤蛋白p21 ras

6、）的誘導情況，并利用TAT方法對暴露于OPFR/s的A549細胞中的OPFR/s和這三個蛋白質(zhì)進行同時定量分析。實驗通過優(yōu)化前處理方法將A549細胞單一/復合暴露于不同的有機磷阻燃劑中，盡管TAT方法能夠同時對多個有機磷阻燃劑和多個蛋白生物標志物進行同時定量分析，但均未檢測到IL-6、TNF-alpha及p21 ras蛋白的過度表達。與此同時，還利用ELISA方法對TAT實驗結(jié)果進行驗證。二者的數(shù)據(jù)結(jié)果表明，暴露于有機磷阻燃劑的A549