家蠶滯育解除過程中相關(guān)氯離子通道蛋白基因及輔酶研究.pdf

1、家蠶是研究卵滯育的重要模式昆蟲之一，具有良好的可調(diào)控性和操作性并取得了相當(dāng)多的研究成果。本研究以932品種的蠶卵為實驗材料，通過多種不同方式處理蠶卵，獲得最佳的解除滯育的方式；利用生物信息學(xué)、分子生物學(xué)和基因工程等技術(shù)方法，篩選出鹽酸解除滯育過程中的氯離子通道蛋白基因，進行克隆和表達分析；同時研究了胚胎發(fā)育過程四種輔酶的變化，獲得主要結(jié)果如下：
　?。?）蠶卵在鹽酸和DMSO中浸漬不同時間得到的孵化率不同。蠶卵產(chǎn)后20h進行浸酸，

2、浸酸時間0.5~1.5min時，隨著浸酸時間的增加孵化率逐漸上升；浸酸時間1.5~6min時，孵化率保持在95％~97%之間。蠶卵產(chǎn)后20h利用DMSO浸漬，浸漬時間15~40min時，孵化率逐漸上升；浸漬時間40~50min時，孵化率保持在88%~90%之間；浸漬時間60min時，孵化率下降為86%。蠶卵產(chǎn)后10d完全進入滯育，置于5℃冷庫保存90d，再用鹽酸進行刺激，浸酸時間4~6min時，孵化率維持在94%~95%之間；浸酸7mi

3、n時，孵化率下降為93%，發(fā)現(xiàn)蠶卵死亡現(xiàn)象。
　?。?）克隆家蠶細胞內(nèi)氯離子通道（BmCLIC）、家蠶谷氨酸氯離子通道（BmGluCl）和家蠶γ-氨基丁酸氯離子通道受體（Bmγ-Cl）三個氯離子通道基因。根據(jù)候選基因的CDS序列設(shè)計引物，通過PCR、瓊脂糖電泳、膠回收、連接載體、酶切和測序等技術(shù)，成功克隆出BmCLIC、BmGluCl和Bmγ-Cl3個目的基因。
　?。?）通過實時熒光定量PCR技術(shù)，檢測了BmCLIC、Bm

4、GluCl和Bmγ-Cl基因在不同處理卵和胚胎發(fā)育過程中的轉(zhuǎn)錄表達情況。發(fā)現(xiàn)產(chǎn)后20h卵和冷藏卵浸酸處理后BmCLIC、BmGluCl和Bmγ-Cl基因相對表達量都相應(yīng)提高，表明浸酸可以誘導(dǎo)目的基因上調(diào)。在滯育卵中，BmCLIC基因第1d相對表達量最大，隨著發(fā)育經(jīng)過逐漸減??；BmGluCl基因第1d相對表達量最大，在發(fā)育過程中先減小后增加；Bmγ-Cl基因第2d相對表達量最大值為2.04，隨著發(fā)育經(jīng)過逐漸減小。在即時浸酸卵和 DMSO處

5、理卵發(fā)育過程中的三個候選基因都有相同的變化趨勢。
　?。?）檢測了滯育卵和即時浸酸卵的胚胎發(fā)育1~9d中的乙酰輔酶A、黃素腺嘌呤二核苷酸、輔酶Ⅰ和輔酶Ⅱ四種輔酶的變化。乙酰輔酶A在滯育卵發(fā)育過程中，乙酰輔酶A呈現(xiàn)持續(xù)下降；在浸酸卵發(fā)育前期持續(xù)下降，第5d后緩慢回升。FAD在滯育卵發(fā)育前期呈現(xiàn)上升，第5d后呈現(xiàn)下降趨勢；在即時浸酸卵發(fā)育過程中，每克蛋白中的FAD量從第1d的0.00024pg一直上升到第9d的0.00102pg。NA