電壓門控氯離子通道ClC-7在小鼠牙齒發(fā)育中的作用研究.pdf

1、牙齒的發(fā)育是一個長期、復(fù)雜的生物學(xué)過程，包括上皮間充質(zhì)相互作用、細胞分化、形態(tài)發(fā)生、組織礦化和萌出，在這一過程中有眾多生物因子參與并互相協(xié)調(diào)構(gòu)成調(diào)控牙齒發(fā)育的信號網(wǎng)絡(luò)。
　　氯離子通道是生物體內(nèi)一種重要的陰離子通道，它們在細胞膜和胞內(nèi)細胞器質(zhì)膜的跨膜轉(zhuǎn)運中起著特定的生物學(xué)功能。最新的實驗證據(jù)顯示，牙齒組織中有氯離子通道存在，某些氯離子通道基因敲除小鼠模型（CFTR和ClC-5）出現(xiàn)了明顯的牙齒結(jié)構(gòu)和形態(tài)異常。ClC-7是電壓門控氯

2、離子通道家族的一個成員，在體內(nèi)廣泛存在。研究表明ClC-7與某些骨遺傳性疾病密切相關(guān)，人們在研究Clcn7-/-小鼠的過程中發(fā)現(xiàn)，Clcn7-/-小鼠表現(xiàn)出嚴重的視網(wǎng)膜變性和骨硬化癥等癥狀，并伴有牙齒不萌出的現(xiàn)象，同時在嬰兒骨硬化患者中也發(fā)現(xiàn)了CLCN7基因的突變型。結(jié)合氯離子通道特別是ClC-7的生理功能和牙胚發(fā)育的自身特點，以及牙齒和骨在組織結(jié)構(gòu)上具有的相似性，我們提出這樣的假設(shè)：ClC-7可能參與了牙齒的發(fā)育過程。
　　本課

3、題采用免疫組織學(xué)、原位雜交、RT-PCR和細胞培養(yǎng)等技術(shù)進行了以下三個部分的實驗研究：
　　第一部分ClC-7在小鼠牙胚中的表達研究
　　本部分首先應(yīng)用RT-PCR方法證實出生1d的小鼠牙胚中有Clcn7的表達，然后應(yīng)用免疫熒光技術(shù)來確定小鼠牙胚中ClC-7蛋白表達分布模式和原位雜交的方法觀察Clcn7mRNA在小鼠牙胚中的表達。ClC-7蛋白和Clcn7mRNA在小鼠鐘狀期牙胚中廣泛表達。小鼠磨牙牙胚鐘狀早期，內(nèi)釉上皮層細

4、胞、中間層細胞、星網(wǎng)狀層細胞、牙乳頭細胞都有ClC-7陽性表達，內(nèi)釉上皮層呈強陽性表達；小鼠磨牙牙胚鐘狀晚期，ClC-7蛋白和Clcn7mRNA在成釉細胞、成牙本質(zhì)細胞中存在陽性表達，同時在牙乳頭細胞、星網(wǎng)狀層細胞也呈陽性表達。這些實驗結(jié)果說明電壓門控氯離子通道ClC-7可能在牙齒發(fā)育過程中具有一定的調(diào)控作用，可能參與了成牙本質(zhì)細胞、成釉細胞的生理過程。
　　第二部分ClC-7在牙齒相關(guān)細胞中的表達研究
　　本部分實驗采用R

5、T-PCR和免疫組織化學(xué)方法檢測了Clcn7mRNA和ClC-7蛋白在體外培養(yǎng)的成釉細胞樣細胞LS8、成牙本質(zhì)細胞樣細胞MDPC-23中的表達情況。結(jié)果表明，成釉細胞樣細胞LS8、成牙本質(zhì)細胞樣細胞MDPC-23中都有Clcn7mRNA和ClC-7蛋白的表達，兩種細胞中Clcn7mRNA表達水平?jīng)]有顯著差異，但成牙本質(zhì)細胞樣細胞MDPC-23中ClC-7蛋白表達水平要高于成釉細胞樣細胞ClC-7蛋白表達水平。本部分結(jié)果揭示，成釉細胞樣細

6、胞LS8、成牙本質(zhì)細胞樣細胞MDPC-23可以做為進一步研究ClC-7參與牙齒發(fā)育調(diào)控機制的細胞模型，為今后研究ClC-7在成釉細胞、成牙本質(zhì)細胞中的生理作用提供了實驗基礎(chǔ)。
　　第三部分ClC-7在牙乳頭細胞分化中的作用研究
　　本部分采用原代細胞培養(yǎng)技術(shù)，體外培養(yǎng)小鼠牙乳頭細胞，分為實驗組和對照組，實驗組同時加入終濃度為25ng/ml的M-CSF和終濃度為50ng/ml的RANKL誘導(dǎo)48h，對照組不加任何誘導(dǎo)因子，然后

7、采用免疫熒光染色、原位雜交和RT-PCR的方法對實驗組和對照組中ClC-7蛋白和Clcn7mRNA表達進行比較。實驗結(jié)果表明，加入誘導(dǎo)因子M-CSF和RANKL的牙乳頭細胞中ClC-7蛋白和Clcn7mRNA表達均高于對照組。本部分研究表明，M-CSF和RANKL可以提高ClC-7在牙乳頭細胞中的表達水平，可能促進了牙乳頭細胞的分化，但M-CSF和RANKL促進牙乳頭細胞中ClC-7蛋白和Clcn7mRNA水平升高的機制和途徑有待于進一