灰飛虱谷氨酸門控氯離子通道(LsGluCls)的表達模式和藥理學特性研究.pdf

1、谷氨酸門控氯離子通道(GluCls)是半胱氨酸環(huán)配體門控離子通道超家族(cys-loopLGIC superfamily)中的一類，對控制吞咽、運動、感知和保幼激素的生物合成等可能起關鍵作用。由于GluCls只存在于無脊椎動物體內，因此是很多高選擇性藥劑的作用靶標。本論文以灰飛虱作為供試昆蟲，研究了GluCls的分子生物學和藥理學特征，包括基因序列分析、剪接體表達模式分析和功能驗證等。我們所發(fā)現(xiàn)的LsGluCl基因的新的剪接體豐富了昆蟲

2、GluCls的多樣性，并進一步探索了其分子生物學和藥理特征，本研究可為對以此為作用靶標的新藥劑開發(fā)提供理論基礎。
　　1、灰飛虱GIuCl基因序列分析
　　采用巢式PCR技術分別克隆了氟蟲腈敏感和抗性2個品系及1個田間種群灰飛虱的GluCl基因，對三個品系（種群）的GluCl基因進行了多態(tài)性分析。結果發(fā)現(xiàn)了80個核苷酸多態(tài)性(SNPs)，共導致了20個氨基酸變化;進一步重點分析這20個氨基酸變化在三個品系（種群）中的差異，試

3、圖從多態(tài)性方面討論GluCl基因與藥劑使用和抗性水平的關系。結果顯示灰飛虱GluCl基因存在大量的多態(tài)性位點，遺傳背景相同的室內敏感和氟蟲腈抗性品系存在7個氨基酸差異(V68I、I73L、S79A、K80T、D82S、V84I、K85T)，遺傳背景不同的田間種群與室內敏感品系也有6個氨基酸的差異(D63A、P66H、A67T、C226Y、P259L、R352C)，且多態(tài)性位點大部分位于親水的N端胞外區(qū)，但由于替換頻率低，無法說明灰飛虱對

4、氟蟲腈的抗性是因為GluCl基因發(fā)生氨基酸突變引起的。
　　通過基因克隆測序發(fā)現(xiàn)灰飛虱GluCl轉錄本存在兩個剪接位點、兩種剪接模式。第一個剪接位點位于LSGluCl的N端，即保守的exon3，在昆蟲基因組中存在外顯子exon3a，exon3b和exon3c，通過互斥外顯子的剪接形式形成了不同剪接體LsGluCl-A、LsGluCl-B和LsGluCl-C;第二個剪接位點是在第三和第四跨膜區(qū)之間的胞內區(qū)域，附加了一段編碼SDDVL

5、FQ的短肽，出現(xiàn)了另一種剪接形式即可變的3'端，形成了兩種不同的GluCl蛋白，即LsGluCL-L和LsGluCl-S。
　　2、灰飛虱GluCl剪接體表達模式
　　根據不同剪接體的不同堿基序列設計引物，通過熒光定量PCR技術，得到不同剪接體在灰飛虱不同發(fā)育階段及成蟲不同組織的表達差異。定量結果顯示，首先，第一個剪接位點所形成的三種剪接體在灰飛虱不同發(fā)育階段，LsGluCl-A剪接體一直高水平表達，LsGluCl-B在各個

6、階段表達水平低于A高于C，且表達水平在不同階段無明顯變化，而LsGluCl-C則隨著蟲齡增大表達水平隨之上升，在4齡后與B的表達水平達到一致;其次，另一個剪接位點形成的剪接體LsGluCl-L在灰飛虱4齡之前是LsGluCl基因的主要存在形式，而在5齡和雌成蟲期，LsGluCl-S剪接體表達量顯著增多。GluCls主要存在于昆蟲的中樞神經系統(tǒng)和肌肉神經中，所以在頭部和腿部表達量較高，本論文所得到的結果也顯示所有剪接體都在成蟲頭部表達量最

7、高，其中LsGluCl-A的表達水平顯著高于B和C;LsGluCl-S和LsGluCl-L的表達水平基本一致。在抗、感品系LsGluCl不同剪接體表達差異中顯示，氟蟲腈抗性品系中，只有LsGluCl-A剪接體表達水平明顯下降(p＜0.05），而其他剪接體則沒有明顯變化(p＞0.05)，結果最終導致總型LsGluCl在氟蟲腈抗性品系中表達量下降。
　　3、灰飛虱GluCls電藥理學特性研究
　　在無脊椎動物的神經系統(tǒng)中，抑制性

8、谷氨酸受體（IGluR）與離子通道偶聯(lián)，對神經遞質谷氨酸起快速反應，從而達到抑制作用。本論文從灰飛虱體內克隆得到了GluClα亞基，采用體外轉錄、cRNA注射、爪蟾卵母細胞表達和雙電極電壓鉗記錄來研究其功能。對照結果顯示L-谷氨酸(濃度為1μM)對未注射LsGluCl的cRNA的卵母細胞（同體積的超純水）不能誘發(fā)出可見電流，而記錄的50例注射cRNA的細胞中，持續(xù)灌流谷氨酸(1μM)，可在95％的細胞上誘發(fā)出內向電流。不同濃度的谷氨酸灌

9、流所誘發(fā)的電流幅度隨谷氨酸濃度的升高而增大，利用origine8.0軟件對谷氨酸誘發(fā)電流的量效關系曲線進行擬合，擬合結果顯示:EC50=18.69±3.5μM。
　　在20μM谷氨酸灌流的基礎之上，測定拮抗劑氟蟲腈和PTX對GluCls的抑制作用。其對爪蟾卵母細胞表達的LsGluCls通道電流的抑制作用，均具有濃度依賴特性，IC50值分別為396±96nM、67.5±18.5μM，可見氟蟲腈對GluCls的抑制效率顯著高于PTX。