氯離子通道蛋白-3和水離子通道蛋白-1在糖皮質(zhì)激素性白內(nèi)障晶狀體中表達(dá)水平變化的研究.pdf

1、目的:
　　 糖皮質(zhì)激素已經(jīng)廣泛、有效的應(yīng)用于臨床工作中。長(zhǎng)時(shí)間全身、局部應(yīng)用糖皮質(zhì)激素可以發(fā)揮抗炎、抗免疫等有益作用，但是同時(shí)也帶來(lái)巨大副作用，而糖皮質(zhì)激素性白內(nèi)障(glucocorticoidinducedcataract，GIC)是其在眼部較常見(jiàn)的并發(fā)癥之一。本實(shí)驗(yàn)采用建立糖皮質(zhì)激素性白內(nèi)障離體培養(yǎng)模型，觀察離體培養(yǎng)的晶狀體在不同的藥物濃度地塞米松影響下的混濁程度，同時(shí)研究不同濃度的地塞米松對(duì)晶狀體中氯離子通道蛋白-3mR

2、NA(CLC-3mRNA)與水離子通道蛋白-1mRNA(AQP-1mRNA)的表達(dá)的影響。探討CLC-3和AQP-1與糖皮質(zhì)激素性白內(nèi)障的發(fā)病關(guān)系，為進(jìn)一步激素性白內(nèi)障的研究提供理論依據(jù)。
　　 方法:
　　 建立大鼠離體晶狀體糖皮質(zhì)激素性白內(nèi)障模型:取3月齡雌性新鮮的大鼠晶狀體共144只，隨機(jī)分為3組（每小組42只晶狀體）:對(duì)照組（給予不含地塞米松的培養(yǎng)液孵育），實(shí)驗(yàn)組1（給予含5mmol/L地塞米松培養(yǎng)液孵育），實(shí)驗(yàn)

3、組2（給予含10mmol/L地塞米松培養(yǎng)液孵育）。孵育條件各組均相同。分別于第1，3，5，7天隨機(jī)抽取12只晶狀體，觀察并記錄晶狀體形態(tài)及混濁程度，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)各組晶狀體中CLC-3mRNA和AQP-1mRNA含量的變化。
　　 結(jié)果:
　　 1.成功建立大鼠離體晶狀體糖皮質(zhì)激素性白內(nèi)障模型，并進(jìn)行相應(yīng)分期分組。
　　 2.觀察晶狀體混濁程度（參考Mathur等[1]離體晶狀體的分級(jí)方法）:

4、>　　 2.1.對(duì)照組晶狀體均未出現(xiàn)混濁
　　 2.2.實(shí)驗(yàn)組1（5mmol/L）:晶狀體第1天未出現(xiàn)混濁，第3天大部分晶狀體呈現(xiàn)1級(jí)混濁(11/12)，第5天大部分晶狀體呈現(xiàn)2級(jí)混濁(10/12)，第7天晶狀體呈現(xiàn)3級(jí)混濁(10/12);第3，5，7天分別與同期相應(yīng)的對(duì)照組相比，晶狀體混濁程度間差異均有顯著性(P＜0.01);第1，3，5，7天各相鄰時(shí)間點(diǎn)之間相比晶狀體混濁程度間差異均有顯著性(P＜0.01，P＜0.05)。

5、
　　 2.3.實(shí)驗(yàn)組2(10mmol/L):晶狀體第1天未出現(xiàn)混濁，第3天晶狀體大部分呈現(xiàn)2級(jí)混濁(10/12)，第5天晶狀體大部分呈現(xiàn)3級(jí)混濁（3級(jí)9/12，4級(jí)2/12）第7天晶狀體呈現(xiàn)兩種程度混濁混濁(4級(jí)8/12，5級(jí)4/12)，第3，5，7天分別與同期相應(yīng)的對(duì)照組相比，晶狀體混濁程度間差異均有顯著性(P＜0.01);第1，3，5，7天各相鄰時(shí)間點(diǎn)之間相比晶狀體混濁程度間差異均有顯著性(P＜0.01，P＜0.05)。<

6、br>　　 3.實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果示:
　　 3.1.CLC-3mRNA表達(dá)的觀察:
　　 3.1.1.對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組1（5mmol/L）及實(shí)驗(yàn)組2(10mmol/L)晶狀體中均有CLC-3mRNA基因的表達(dá)。
　　 3.1.2.對(duì)照組CLC-3mRNA表達(dá)量在體外培養(yǎng)第1，3，5，7天各時(shí)間點(diǎn)無(wú)明顯變化(p＞0.05)。
　　 3.1.3.實(shí)驗(yàn)組1(5mmol/L):CLC-3mRNA表達(dá)量于

7、第3、5、7天逐漸增高，與同期相應(yīng)對(duì)照組相比，差異有顯著性(p＜0.01);并且各時(shí)間點(diǎn)相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01);
　　 3.1.4.實(shí)驗(yàn)組2(10mmol/L):CLC-3mRNA表達(dá)含量于第3天開始增高，第5天時(shí)達(dá)到高峰，與同期相應(yīng)對(duì)照組相比，差異有顯著性(p＜0.01)，第7天時(shí)明顯下降，降至正常值的50％，差異有顯著性(p＜0.01);并且各時(shí)間點(diǎn)相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01)。
　　 3.

8、1.5.實(shí)驗(yàn)組2（10mmol/L）與同期相應(yīng)實(shí)驗(yàn)組1(5mmol/L)相比:第3天，第5天CLC-3mRNA表達(dá)量明顯增高，第7天明顯降低，變化呈藥物濃度依賴性，差異有顯著性(p＜0.01)。
　　 3.1.6.1、2和3級(jí)晶狀體中CLC-3mRNA的表達(dá)量呈逐漸增高趨勢(shì)，且均高于透明晶狀體(p＜0.01)，3級(jí)晶狀體中CLC-3mRNA的表達(dá)量最高，4級(jí)和5級(jí)時(shí)其表達(dá)量呈逐漸遞減趨勢(shì)，且均低于透明晶狀體組，5級(jí)時(shí)CLC-3m

9、RNA的表達(dá)量最低，降至透明晶狀體的50％，差異有顯著性(p＜0.01)。
　　 3.2.AQP-1mRNA表達(dá)的觀察:
　　 3.2.1.對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組1(5mmol/L)及實(shí)驗(yàn)組2（10mmol/L）晶狀體中均有AQP-1mRNA基因的表達(dá)。
　　 3.2.2.對(duì)照組AQP-1mRNA表達(dá)量在體外培養(yǎng)第1，3，5，7天各時(shí)間點(diǎn)無(wú)明顯變化(p＞0.05)。
　　 3.2.3.實(shí)驗(yàn)組1(5mmol/L):

10、AQP-1mRNA表達(dá)量于第3、5、7天逐漸降低，與同期相應(yīng)對(duì)照組相比，差異有顯著性（第3天與同期相應(yīng)對(duì)照組比p＜0.05）（第
　　 5、第7天與同期相應(yīng)對(duì)照組比p＜0.01）。并且各時(shí)間點(diǎn)相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01);
　　 3.2.4.實(shí)驗(yàn)組2(10mmol/L):AQP-1mRNA表達(dá)量子第3、5、7天逐漸降低，與同期相應(yīng)對(duì)照組相比，差異有顯著性(p＜0.01)。并且各時(shí)間點(diǎn)相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜

11、0.01);
　　 3.2.5.實(shí)驗(yàn)組2(10mmol/L)與同期相應(yīng)實(shí)驗(yàn)組1(5mmol/L)相比:AQP-1mRNA的表達(dá)水平均明顯降低，變化呈藥物濃度依賴性，差異有顯著性(p＜0.01)。
　　 3.2.6.1～5級(jí)晶狀體中AQP-1mRNA表達(dá)量呈逐漸降低趨勢(shì)，且均低于透明晶狀體。2～5級(jí)晶狀體AQP-1mRNA表達(dá)量與透明晶狀體相比差異有顯著性(p＜0.01)。
　　 結(jié)論:
　　 1.大劑量糖

12、皮質(zhì)激素應(yīng)用在短期內(nèi)即可造成晶狀體的混濁，并且晶狀體的混濁程度與糖皮質(zhì)激素的濃度和應(yīng)用時(shí)間長(zhǎng)短均呈現(xiàn)正相關(guān)。
　　 2.體外培養(yǎng)晶狀體中有CLC-3mRNA的表達(dá)，在激素性白內(nèi)障模型中，隨著晶狀體混濁程度增加其表達(dá)量呈現(xiàn)遞增趨勢(shì)并且達(dá)到峰值后出現(xiàn)驟降，提示CLC-3mRNA與激素性白內(nèi)障發(fā)生及發(fā)展密切相關(guān):隨著白內(nèi)障混濁程度的增加，CLC-3不斷激活，但是當(dāng)混濁達(dá)到一定程度后CLC-3激活達(dá)到極限，隨后逐漸失活，證實(shí)其對(duì)一定程度

13、的晶狀體混濁起保護(hù)作用。
　　 3.體外培養(yǎng)晶狀體中有AQP-1mRNA表達(dá)，在激素性白內(nèi)障模型中，隨著晶狀體混濁程度增加其表達(dá)量呈現(xiàn)遞減趨勢(shì)，且其降低程度與藥物濃度和作用時(shí)間均呈現(xiàn)正相關(guān)，提示AQP-1與糖皮質(zhì)激素發(fā)生及發(fā)展密切相關(guān):糖皮質(zhì)激素類藥物在某種程度上對(duì)晶狀體中AQP-1有抑制作用，且藥物濃度越高，作用時(shí)間越長(zhǎng)，其抑制作用越強(qiáng)。
　　 本實(shí)驗(yàn)的創(chuàng)新點(diǎn):
　　 1.首次采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法從基因水