SNAREs蛋白和鉀離子通道蛋白參與調節(jié)大菱鲆免疫應答.pdf

1、鰻弧菌是危害我國水產養(yǎng)殖業(yè)的主要病原菌。本文采用分子生物學,免疫學和膜片鉗等技術,研究養(yǎng)殖魚類大菱鲆(scophthalmus maximus),在受到病原菌感染后,snare蛋白和鉀離子通道參與免疫應答防御機制的調控作用。通過腹腔注射半致死劑量的鰻弧菌,研究受感染的大菱鲆在感染初期所誘發(fā)的一系列應激反應。通過鑒定外周血液白細胞的吞噬和殺滅鰻弧菌的活性,以及外周血、脾臟和頭腎白細胞所發(fā)生的呼吸爆發(fā)的活性,血清中細胞因子一白介素1 β的含

2、量的變化,研究抗鰻弧菌的先天性免疫應答防御機制。結果發(fā)現在感染24hr后,白細胞吞噬鰻弧菌的百分數從47.25[％]增加到61.18[％],吞噬鰻弧菌的指數從4.68增加到5.62;殺菌活性從1.26增加到1.73;呼吸爆發(fā)活性od600值從0.07增加到0.2;比較外周血、脾臟和頭腎白細胞三種組織所發(fā)生的呼吸爆發(fā)的活性發(fā)現,脾臟白細胞的呼吸爆發(fā)活性最高,頭腎略高于血液,感染8hr后呼吸爆發(fā)活性平均大于1.7;血清中細胞因子一白介素1

3、β的0d490值從正常魚對照的0.0523±0.014增長到感染24hr的最大值0.47±0.033,感染24 hr后的表達量大約是未感染對照的9倍,感染后增加量顯著(p<0.05)。進一步證明感染初期先天性免疫應答防御在保護魚體中的重要作用。 snare蛋白是一種參與調控所有真核生物細胞分泌和胞吐的膜蛋白。為了測定snare蛋白是否也參與大菱鲆白細胞的分泌和胞吐,首先通過rt-pcr方法鑒定大菱鲆體內存在的snare蛋白,設計

4、兩種snare蛋白(v-snare,vamp-2和t-snare,snap-25)基因的引物,從外周血白細胞和腦組織中都克隆出snares蛋白中的vamp-2的cdna,而snap-25的cdna僅從腦組織中克隆出。經過序列分析發(fā)現,大菱鲆的vamp-2基因與多數哺乳動物的vamp-2基因同源性在80[％]以上,而氨基酸序列的同源性在90.6[％]以上;大菱鲆snap-25基因與多數哺乳動物的snap-25基因也在83[％]以上,氨基酸

5、序列的同源性在89[％]以上。結果表明這兩種snare蛋白在大菱鲆體內也是非常保守。為了證明snare蛋白是否參與調控大菱鲆白細胞細胞因子白介素-1 β的分泌,研究分泌調控蛋白-snares在大菱鲆先天性免疫應答過程中的作用。通過rt-pcr,免疫印跡,免疫組化技術克隆了大菱鲆vamp-2基因,并研究了其在細胞因子白細胞介素-1 β分泌中的調控作用。 證明VAMP-2蛋白存在于大菱鲆外周血白細胞內，其核苷酸序列與斑馬魚和鱸魚的同

6、源性分別為88.2％和93.O％。受鰻弧菌感染后，大菱鲆VAMP-2蛋白在轉錄和翻譯水平都顯著增加，并且在時間上和表達量上與IL-1β分泌一致。以上結果證明VAMP-2在魚類免疫細胞因子IL-lβ的分泌和先天性免疫應答調控中的重要作用。淋巴細胞是直接參與獲得性免疫應答的重要效應細胞。淋巴細胞膜上存在許多離子通道，參與調控鈣離子動態(tài)平衡和信號傳導。其中鉀離子通道在調控T淋巴細胞的鈣離子信號，淋巴細胞的分化、增殖、激活免疫應答方面起關鍵作用