鈣調(diào)蛋白抑制劑對鉀離子通道的直接阻斷作用和離子通道與前脂肪細胞增殖的關系.pdf

1、第一部分鈣調(diào)蛋白抑制劑對穩(wěn)定表達在HEK293細胞的鉀通道（hERG、hKv1.5和Kir 2.1）的直接阻斷作用研究
　　 背景和目的：N-(6-Aminohexyl)-5-chloro-1-naphthalenesulfonamide(W-7)是一種眾所周知的鈣調(diào)蛋白（calmodulin）抑制劑，一般被用做研究calmodulin 調(diào)節(jié)細胞內(nèi)鈣信號相關的通路的工具藥。本課題旨在利用穩(wěn)定表達hERG（Kv11.1），hKv1

2、.5和Kir2.1 鉀通道的HEK293 細胞，研究W-7是否對上述電流的直接抑制作用。比較研究了W-7 對野生型hERG 通道與三種突變型的hERG 通道的作用，以明確W-7 與hERG 通道結合的分子機制。同時也研究了另外一種鈣調(diào)蛋白抑制劑（W-13）對hERG 電流以及hKv1.5和Kir 2.1 電流的作用。采用全細胞膜片鉗技術記錄表達于HEK293 細胞的hERG 鉀電流，hKv1.5和Kir 2.1 鉀電流。
　　

3、結果：CaM 抑制劑W-7 可以抑制hERG 鉀電流，hKv1.5和Kir 2.1 電流。W-7 濃度依賴性的抑制hERG 電流，半數(shù)最大效應濃度IC50 為3.5 μM。W-7 對hERG 電流的抑制也具有電壓依賴性特點，在+10 mV到+60 mV之間抑制作用更加明顯。W-7 可使hERG 電流電壓依賴性穩(wěn)態(tài)激活和失活曲線左移，失活速度加快。電極內(nèi)液給予10μM W-7 對hERG 電流產(chǎn)生微弱的抑制作用，弱于細胞外液給予W-7 對

4、hERG的抑制作用。在不含EGTA的電極內(nèi)液中滲透給予500nM CaM（以確保細胞內(nèi)游離Ca2+維持在生理水平）對hERG 電流沒有明顯的作用，而且不影響細胞外液給予W-7 對hERG電流的抑制程度。hERG 鉀通道S6 跨膜結構域的氨基酸突變位點Y652A和F656V，以及孔道區(qū)域突變位點S631A 可改變W-7 對hERG 通道的敏感性，W-7 對3種突變hERG 通道的半數(shù)抑制濃度（IC50s）分別為5.5 μM，9.8 μM和

5、25.4 μM。此外W-7也可抑制hKv1.5和Kir 2.1 電流，其IC50分別為6.5 μM和13.4 μM。另外一種鈣調(diào)蛋白抑制劑W-13 也可抑制hERG 電流，hKv1.5和Kir 2.1 電流，IC50分別為19.8μM,75.54μM,43.75μM。
　　 結論：以上研究結果提示鈣調(diào)蛋白抑制劑W-7 可直接阻斷表達于HEK293 細胞上的hERG 鉀電流，hKv1.5和Kir 2.1 電流。因此在解釋W-7 對

6、離子通道的影響時需謹慎。
　　 第二部分3T3-L1 前脂肪細胞離子通道的表達以及離子通道與細胞增殖的關系
　　 背景和目的：小鼠3T3-L1 前脂肪細胞被廣泛用作代謝方面的研究，然而，其細胞生理（如功能性離子通道的表達）還未被闡明。本研究主要采用全細胞膜片鉗技術，RT-PCR，免疫印跡（western blot），細胞增殖檢測方法來探索3T3-L1 前脂肪細胞離子通道的表達以及離子通道是否參與細胞增殖調(diào)節(jié)。
　　

7、 結果：我們發(fā)現(xiàn)3T3-L1 前脂肪細胞表達三種類型的離子通道,39％的細胞可記錄到中電導的鈣激活的鉀電流（Ca2+-activated K+current(IKCa)），15％的細胞記錄到內(nèi)向整流鉀電流（Kir），在等滲（1T）條件下只有8％的細胞可記錄到氯通道電流，而有趣的是，在低滲透壓（0.8T）條件下幾乎所有的細胞可記錄到氯電流，提示該氯通道為容量激活的氯通道。3T3-L1 細胞所記錄到的Ikir 電流可被Ba2+阻斷；IKC

8、a 電流可以被中等電導的鈣激活的鉀電流阻斷劑clotrimazole 阻斷，提示所記錄到鈣激活的鉀電流為IKCa 電流。Icl 可以被氯通道阻斷劑DIDS 阻斷。RT-PCR 結果表明了3種通道m(xù)RNAs的顯著表達，KCa3.1基因（IKCa），Kir2.1基因（Ikir），和Clcn3（Icl.vol）。我們采用免疫印跡的方法可檢測到這三種通道蛋白的表達。MTT和3H 胸腺嘧啶滲入法檢測細胞增殖結果表明，IKCa 阻斷劑clotrim

9、azole和Icl.vol 阻斷劑DIDS 均可濃度依賴性的抑制3T3-L1 前脂肪細胞的增殖，clotrimazole（3μM）和DIDS（200μM）對細胞增殖的抑制率分別為(10.55±2.97％和60.98±1.79％，P<0.01 vs control)。使用特異性的RNA 干擾（short interference）序列，將KCa3.1 或Clcn3基因沉默，KCa3.1 或Clcn3siRNA（100nM）均可顯著下調(diào)IK

10、Ca 或Icl.vol的mRNA和蛋白表達，并可抑制細胞增殖，最大抑制率分別為(11.29±2.5％和12.76.29±2.7％，P<0.05 vs control)。流式細胞儀分析細胞周期結果表明，clotrimazole和DIDS 均可濃度依賴性的增加G0/G1 期細胞比例，clotrimazole(3 μM)和DIDS(200 μM)可使G0/G1 期細胞停滯，分別使G0/G1 期細胞比例從對照組的50.93±1.64％增加至55

11、.29±3.13％（P＜0.01）和70.21±4.09％(P＜0.01)，并可降低S 期的細胞比例。特異性的KCa3.1和Clcn3 siRNA 干擾序列將通道基因沉默后可得到與特異性阻斷劑相似的結果，與control siRNA組相比，特異性的KCa3.1 siRNA（100nM）使G0/G1 期的細胞比例從44.38±4.5％增加至48.56±4.89％（n=3，P＜0.01），而Clcn3 siRNA（100nM）可使從G0/G