Natratoxin：作用于A型鉀電流離子通道的抑制劑的結(jié)構(gòu)與功能研究.pdf

1、蛇毒中分泌型磷脂酶A2被廣泛用來(lái)作為藥理學(xué)工具，以研究它們?cè)诟鞣N不同的病理生理過(guò)程中的作用。其中，部分分泌型磷脂酶A2被發(fā)現(xiàn)具有阻斷電壓門控型鉀離子通道(K<,v> channels)的作用。然而，大多數(shù)關(guān)于其對(duì)離子通道作用的研究是通過(guò)作用于運(yùn)動(dòng)神經(jīng)末梢間接完成的，極少研究結(jié)果是直接作用于神經(jīng)元細(xì)胞的。這里本文報(bào)道了一種新的蛇毒分泌型磷脂酶A2神經(jīng)毒素：natratoxin，它來(lái)源于中華眼鏡蛇，在天然狀態(tài)下以單體形式存在。經(jīng)SDS電泳，

2、該蛋白的分子量為14 kDa左右。根據(jù)測(cè)定的N端序列和其它蛇毒的同源蛋白的高度保守序列設(shè)計(jì)了引物，首次從蛇腺中克隆natratoxin全長(zhǎng)cDNA，其中360bp為蛋白編碼框，編碼119個(gè)氨基酸殘基。全長(zhǎng)序列比對(duì)顯示它和其他種屬的蛇毒PLA2蛋白有很高的同源性。通過(guò)對(duì)背根神經(jīng)節(jié)的神經(jīng)元全細(xì)胞膜片鉗確定了其功能特征，發(fā)現(xiàn)natratoxin有效地抑制了A型鉀電流并改變了通道的門控特性。因此，natratoxin是作為一個(gè)K<,v>通道的門

3、控調(diào)節(jié)劑起作用的。而且實(shí)驗(yàn)證明這一抑制效應(yīng)與其酶活性無(wú)關(guān)。這些結(jié)果表明，該毒素通過(guò)與Kv通道結(jié)合來(lái)執(zhí)行其抑制效應(yīng)。 為了進(jìn)一步闡明這一電生理現(xiàn)象的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，對(duì)natratoxin的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究。在高鹽溶液中獲得了單晶，并且收集到2.2A分辨率的晶體衍射數(shù)據(jù)，晶體的空間群為P4<,1>。利用分子置換的方法獲得了相位，修正了natratoxin的晶體結(jié)構(gòu)。結(jié)構(gòu)分析表明natratoxin單體的結(jié)構(gòu)主要由三個(gè)α螺旋和一對(duì)反平行β

4、折疊構(gòu)成，并由14個(gè)在一級(jí)序列中嚴(yán)格保守的半胱氨酸殘基構(gòu)成的7對(duì)二硫鍵穩(wěn)定其結(jié)構(gòu)。在整體結(jié)構(gòu)上，natratoxin作為sPLA2家族的一員是非常保守的，局部上的差異主要位于鈣結(jié)合區(qū)域和C末端。然而作為一個(gè)K<,v>通道的抑制劑，natratoxin與其它毒素類抑制劑在整體結(jié)構(gòu)上有著巨大的差異。在與其它K<,v>通道抑制劑的比較中我們發(fā)現(xiàn)在natratoxin的C端有一個(gè)功能區(qū)域與其它抑制劑有很高的一致性，而這個(gè)功能區(qū)域在抑制劑與K<,