電壓敏感鈉離子通道抑制劑的篩選及其表達.pdf

1、分布于神經系統(tǒng)的電壓敏感鈉離子通道與疼痛、癲癇等神經疾病有關，使用合適的離子通道抑制劑能夠有效的緩解慢性疾病的困擾。具有ICK模型的小分子多肽是潛在的鈉離子通道抑制劑。因其具有耐酸堿、抗熱及耐受蛋白酶的特點，可作為緩解疼痛的藥物進行開發(fā)使用。
　　從天然毒素中去尋找潛在的鈉離子通道抑制劑，是一件耗時耗力的工作。天然毒素海南Ⅳ是典型的ICK模型分子，含有三對二硫鍵。本研究在保持海南毒素Ⅳ的ICK分子結構基本不變的前提下對其進行改造，

2、隨機化其中的五個關鍵位點，構建了一個隨機5肽cDNA文庫(R5)。
　　酵母雙雜交是研究蛋白質間相互作用且具有高通量篩選特點的技術。本實驗基于酵母雙雜交的方法，選用鼠電壓敏感鈉離子通道1.3 DomainⅡ膜外區(qū)上的S1-S2為誘餌蛋白，對隨機五肽文庫進行高通量的篩選。經過反復試驗，排除假陽性的現(xiàn)象，得到兩個rNav1.3DⅡ的S1-S2的潛在抑制劑，分別命名為R1和R2。同時實驗結果表明，R1、R2無自激活作用。
　　通過

3、分子模擬發(fā)現(xiàn)，R1、R2上分別有一處殘基可能在酵母雙雜交水平上起關鍵作用。實驗結果證實，原本在酵母雙雜交水平上與rNav1.3DⅡ的S1-S2檢測不到相互作用的敬釗毒素Ⅲ，在替換了來自R1或R2的關鍵殘基后結果呈陽性。
　　為了進一步對篩選到的潛在抑制劑R1、R2進行研究，需要獲得蛋白實體。小分子多肽實體的獲得一般有兩種方法可選，化學合成或者是原核表達。但化學合成存在成本高、蛋白活性與天然活性不一致等風險。因此，本實驗采用原核表達