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文檔簡(jiǎn)介
1、目的:
囊性纖維化跨膜電導(dǎo)調(diào)節(jié)因子(cystic fibrosis transmembrane conductanceregulator,CFTR)是一種在上皮細(xì)胞頂膜中表達(dá)的氯離子通道,在調(diào)節(jié)離子和水分的跨膜運(yùn)輸,尤其是分泌型腹瀉的治療方面具有至關(guān)重要的作用。本研究的目的是自中國(guó)傳統(tǒng)中藥中篩選具有CFTR氯離子通道抑制作用的天然活性小分子化合物,以及通過(guò)藥理學(xué)研究解釋傳統(tǒng)中藥的抗瀉機(jī)制,以期為抗瀉藥物的研發(fā)提供理論基礎(chǔ)和事實(shí)
2、依據(jù)。
方法:
1.CFTR氯離子通道功能測(cè)定模型:本研究利用成熟的CFTR功能測(cè)定細(xì)胞模型(熒光淬滅模型)進(jìn)行抑制劑的初步篩選和CFTR氯離子通道的活性分析。該模型是2001年由Galietta等人設(shè)計(jì)的,用于CFTR抑制劑和激活劑的高通量篩選。我們利用小鼠/人CFTR和熒光綠蛋白突變體EYFP(YFP-H148Q)表達(dá)質(zhì)粒穩(wěn)定共轉(zhuǎn)染Fischer大鼠甲狀腺上皮細(xì)胞(FRT),建立氯離子通道功能測(cè)定模型。
3、 2.CFTR抑制劑的高通量篩選和活性引導(dǎo)下的化合物分離解析:利用熒光淬滅模型對(duì)實(shí)驗(yàn)室先前建立的中藥樣品組分庫(kù)的40,000種組分實(shí)施高通量篩選。對(duì)于獲得的活性組分,在活性引導(dǎo)下通過(guò)有機(jī)溶劑抽提、萃取、柱層析和制備型高效液相色譜(Prep-HPLC)等方法分離得到活性單體化合物,并通過(guò)分析型高效液相色譜(Anal-HPLC)、質(zhì)譜(MS)和核磁共振(NMR)等技術(shù)對(duì)活性化合物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析。
3.細(xì)胞水平上的藥理學(xué)活性的分析方
4、法:利用熒光淬滅模型對(duì)獲得的CFTR抑制劑進(jìn)行必要的藥理學(xué)活性分析,其中包括量-效關(guān)系、時(shí)間動(dòng)力學(xué)、可逆性等。
4.離體組織水平上的藥理學(xué)活性分析:利用尤斯灌流室(Using chamber)電壓鉗系統(tǒng)研究活性化合物對(duì)小鼠回腸粘膜以及大鼠結(jié)腸粘膜CFTR介導(dǎo)的短路電流的影響。
5.活體水平上的藥理學(xué)活性研究:利用小鼠腸道閉環(huán)(Closed-loop)實(shí)驗(yàn)測(cè)定中藥活性組分對(duì)霍亂毒素誘導(dǎo)的小鼠腸道液體分泌的抑制作用。
5、r> 結(jié)果:
1.利用CFTR氯離子通道功能測(cè)定細(xì)胞模型,從提取自五百種中草藥的40,000種中藥組分中分離到3種中藥的活性組分,其中包括冬凌草提取物的連續(xù)的8個(gè)活性組分、檳榔提取物的連續(xù)的7個(gè)活性組分以及公丁香提取物的連續(xù)的8個(gè)活性組分。
2.在活性引導(dǎo)下,采取多種分離提取技術(shù)對(duì)冬凌草、檳榔和公丁香中的活性成分進(jìn)行分離。從冬凌草中分離獲得的小分子單體化合物、公丁香的乙酸乙酯提取物和檳榔的水提物中檢測(cè)到CFTR氯離
6、子通道抑制活性,并通過(guò)分析型高效液相色譜對(duì)活性化合物進(jìn)行監(jiān)測(cè)。
3.通過(guò)分析型高效液相色譜、質(zhì)譜和核磁共振技術(shù)對(duì)從冬凌草中提取的活性小分子單體化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析,經(jīng)對(duì)比鑒定該活性化合物為冬凌草甲素。
4.細(xì)胞水平實(shí)驗(yàn)對(duì)冬凌草甲素、公丁香乙酸乙酯提取物和檳榔水提物的CFTR氯離子通道抑制活性進(jìn)行分析,結(jié)果顯示上述化合物/組分均能以劑量依賴的方式抑制CFTR氯離子通道活性,IC50值分別為46.8μM、42.5 mg/L
7、和52mg/L;冬凌草甲素和公丁香乙酸乙酯提取物對(duì)CFTR氯離子通道的抑制作用具有可逆性;公丁香乙酸乙酯提取物和檳榔水提物能夠顯著抑制多種激活劑對(duì)CFTR氯離子通道的激活作用。
5.離體組織水平實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,冬凌草甲素、公丁香乙酸乙酯提取物和檳榔水提物對(duì)跨大鼠結(jié)腸粘膜和小鼠回腸的CFTR氯離子通道介導(dǎo)的短路電流具有顯著的抑制作用。上述化合物/活性組分對(duì)跨大鼠結(jié)腸粘膜的Cl-轉(zhuǎn)運(yùn)的抑制活性的IC50值分別為:62μM、59.7
8、mg/L和93 mg/L;小鼠回腸的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,三種活性化合物/活性組分濃度分別為50μM、50 mg/L和50 mg/L時(shí),即可對(duì)CFTR氯離子通道介導(dǎo)的短路電流起到四成左右顯著的抑制作用。
6.通過(guò)小鼠腸道閉環(huán)實(shí)驗(yàn)對(duì)冬凌草甲素、公丁香乙酸乙酯提取物和檳榔水提物對(duì)小鼠腸道液體分泌速度的抑制作用進(jìn)行分析,結(jié)果表明上述冬凌草甲素(3.644μg)、公丁香乙酸乙酯提取物(10μg)和檳榔水提物(10μg)都能在6小時(shí)的時(shí)間內(nèi)有效
9、抑制霍亂毒素介導(dǎo)的腸道液體分泌。
結(jié)論:
本研究通過(guò)高通量篩選發(fā)現(xiàn)冬凌草中具有CFTR氯離子通道抑制活性的成分,在活性引導(dǎo)下分離提取的活性單體化合物——冬凌草甲素是CFTR氯離子通道天然的小分子抑制劑;首次闡述了傳統(tǒng)止瀉中藥——公丁香的抗瀉機(jī)制,是通過(guò)阻斷CFTR氯離子通道來(lái)抑制腹瀉引起的腸道電解質(zhì)紊亂和體液流失;發(fā)現(xiàn)檳榔對(duì)CFTR氯離子通道的抑制作用,以及中藥檳榔首次被發(fā)現(xiàn)具有抗瀉的新活性;本研究獲得的活性小分子化
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