重組人乙酰膽堿酯酶的表達(dá)純化及其抑制劑篩選.pdf

1、乙酰膽堿酯酶(Acetylcholinesterase，AChE)作為一種存在于膽堿能突觸間隙的由蛋白質(zhì)分子構(gòu)成的生物催化劑，屬于生物神經(jīng)傳導(dǎo)中的一種關(guān)鍵性的酶。它不僅參與細(xì)胞的生長(zhǎng)以及發(fā)育，同時(shí)對(duì)神經(jīng)的再生和神經(jīng)元的發(fā)育也有促進(jìn)作用，并對(duì)維持人體神經(jīng)系統(tǒng)的正常生理功能占有著非常重要的地位。乙酰膽堿(Acetylcholine，ACh)是AChE的水解底物，ACh會(huì)受AChE的催化發(fā)生裂解反應(yīng)，導(dǎo)致ACh的缺失，從而使得各神經(jīng)信號(hào)傳遞失

2、敗。而ACh水平的降低或活性的異常則是造成阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)發(fā)生的主要原因。近年來(lái)，通過(guò)提高ACh的水平來(lái)治療AD，這已經(jīng)成為目前主要的治療方式。因此，通過(guò)抑制AChE來(lái)恢復(fù)或提高ACh的水平是治療AD持續(xù)有效的方法。乙酰膽堿酯酶抑制劑(Acetylcholinesteraseinhibitor, AChEI)能夠選擇性的抑制腦內(nèi)AChE的活性，使ACh在大腦內(nèi)的存留時(shí)間延長(zhǎng)，提高AD病人的膽堿

3、神經(jīng)功能，同時(shí)也能有效緩解病人的認(rèn)知能力障礙降低病人。
　　迄今為止，對(duì)于輕、中度的AD治療AChEI已經(jīng)成為主流產(chǎn)品。經(jīng)美國(guó)FDA批準(zhǔn)上市的6種AChEI，它們分別是他克林(Tararine)、加蘭他敏(Galanthamine)、利伐司替明(Rivastigmine)、石杉?jí)A甲(HuperzineA)以及復(fù)方新藥Namzari和多奈哌齊(Donepezil，E2020)，但是已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的AChEI還有較多缺點(diǎn)存在，例如半衰期短、

4、毒性大以及較嚴(yán)重的膽堿能外周系統(tǒng)的副作用等，這使得它們?cè)谂R床應(yīng)用上面受到一定限制。因此，尋找發(fā)現(xiàn)作用時(shí)間長(zhǎng)、副作用小的新一代AChEI仍是目前治療AD藥物的研究熱點(diǎn)。
　　本研究旨在利用體外人胚腎(HEK293)細(xì)胞建立表達(dá)重組人乙酰膽堿酯酶（Recombinant human acetylcholinesterase，rhAChE）的表達(dá)系統(tǒng)，使用pCMV-AChE質(zhì)粒對(duì)其進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，分泌表達(dá)酶液到培養(yǎng)基，并通過(guò)對(duì)酶動(dòng)力學(xué)的研

5、究來(lái)考察重組表達(dá)蛋白的酶活性。使用DEAE-Sepharose FF親和層析對(duì)高效表達(dá)的重組蛋白進(jìn)行純化，以獲得純度較高、活性較強(qiáng)的重組人乙酰膽堿酯酶，從而建立重組人乙酰膽堿酯酶抑制劑的體外評(píng)價(jià)篩選模型，并應(yīng)用該模型從天然產(chǎn)物及其衍生物中篩選其中藥抑制劑和對(duì)一系列化合物的抑制活性的測(cè)定。
　　1、HEK293細(xì)胞分泌表達(dá)重組人乙酰膽堿酯酶(rhAChE)
　　pCMV-AChE質(zhì)粒由浙江大學(xué)藥學(xué)院所贈(zèng)送。測(cè)定pCMV-ACh

6、E的DNA序列確證AChE部分與AChE結(jié)構(gòu)基因序列(GenBankAccessionNo:NM--000665)一致。通過(guò)陽(yáng)離子脂質(zhì)體LipofectamineTM2000介導(dǎo)pCMV-AChE從而對(duì)HEK293細(xì)胞進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。建立此表達(dá)系統(tǒng)分泌表達(dá)的rhAChE至細(xì)胞培養(yǎng)液中，收集細(xì)胞培養(yǎng)液作為酶液，進(jìn)行AChE活性分析，最終獲得粗酶液進(jìn)行下一步純化。
　　2、rhAChE活性和檢測(cè)體系研究
　　采用改進(jìn)的Ellman

7、方法進(jìn)行酶活檢測(cè):反應(yīng)體系中加入酶液和顯色劑DTNB(5，5'-二硫代雙-2-二硝基苯甲酸)，pH為7.4的PBS，在37℃培養(yǎng)箱孵育6 min，加入底物碘化硫代乙酰膽堿(ATCh)后37℃繼續(xù)孵育16 min，最后加入SDS終止反應(yīng)，使用酶標(biāo)儀測(cè)定在412 nm下的吸光度(OD值)，rhAChE的反應(yīng)速率單位用OD/min來(lái)表示。
　　3、rhAChE的純化和鑒定
　　為獲得純度更高、活性更強(qiáng)的rhAChE，對(duì)收集的細(xì)胞培

8、養(yǎng)液即酶液進(jìn)行活性分析后，通過(guò)透析過(guò)夜，使用DEAE-Sepharose FF親和層析柱梯度洗脫純化，收集蛋白純化液，進(jìn)行活性檢測(cè)，聚乙二醇4000進(jìn)行5倍濃縮，BCA蛋白濃度試劑盒測(cè)得蛋白濃度為0.145 mg/mL，純化液比活力為6.55 U/mg，純化倍數(shù)為9.63，酶活回收率為56％。該酶的相對(duì)分子質(zhì)量約為64 KD。以碘化硫代乙酰膽堿為底物時(shí)，酶的最適反應(yīng)溫度為37℃，最適pH為7.4，最適底物濃度為5 mmol/L。進(jìn)行SD

9、S-PAGE、Native-PAGE鑒定，在分子量64 KD附近出現(xiàn)明顯的rhAChE的單一條帶。純化液進(jìn)行Western blot分析，一抗為Anti-AChE antibody抗體，在分子量64 KD附近出現(xiàn)明顯rhAChE單一條帶。
　　由于重組人乙酰膽堿酯酶的純度會(huì)直接決定最終檢測(cè)的準(zhǔn)確性和可靠性，本實(shí)驗(yàn)對(duì)人的乙酰膽堿酯酶的分離純化及生物學(xué)方面的意義做了研究，即如何使rhAChE的純化效率達(dá)到最大，減少及簡(jiǎn)化純化步驟，使酶

10、活的損失降低，以提高純化的倍數(shù)。
　　4、rhAChE抑制劑的篩選
　　多奈哌齊對(duì)AChE是可逆性的抑制劑，其在粗酶液的IC50為14.0 nmol/L。本研究選擇7個(gè)濃度來(lái)測(cè)定多奈哌齊對(duì)純化液rhAChE的抑制率效果，以化合物摩爾濃度的負(fù)對(duì)數(shù)和酶抑制率進(jìn)行線(xiàn)性回歸，求取IC50值。反應(yīng)體系條件:pH7.4，酶量5μL，多奈哌齊濃度:0，5.0，10.0，20.0，40.0，80.0，160 nmol/L，底物濃度:0.5