FHL2對心臟HERG鉀離子通道表達的調(diào)控作用.pdf

1、研究背景:由人類果蠅相關(guān)基因――HERG(Humanether-a-go-go-relatedgene)編碼的心臟HERG鉀通道屬于電壓依賴性鉀通道,介導快速激活延遲整流鉀電流(rapidlyactivateddelayedrectifierpotassiumcurrents,Ikr)。HERG基因的突變將導致第二型的長QT綜合征(longQTsyndrome,LQTS)。蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用是維持細胞生命活動的重要基礎(chǔ),信號轉(zhuǎn)導、細

2、胞周期調(diào)控、DNA復制、RNA轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)翻譯、蛋白質(zhì)翻譯后加工修飾等功能的完成依賴于蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)的相互作用。既往的研究表明FHL1通過與心臟鉀通道相互作用而發(fā)揮調(diào)控該通道所介導電流IKs(theslowlyactivatingcomponentofthedelayedrectifierK+current,IKs)的功能。IKs和Ikr電流都屬于延遲整流鉀電流,是構(gòu)成心臟動作電位第3相的主要外向電流,對心臟復極發(fā)揮極其重要的作用。而F

3、HL1和FHL2的氨基酸構(gòu)成有著47％的同源性。本實驗的前期工作通過酵母雙雜交技術(shù)、GSTpull-down發(fā)現(xiàn)了FHL2與心臟HERG鉀通道存在相互作用。在此基礎(chǔ)之上,本實驗進一步研究FHL2對心臟HERG鉀通道表達的調(diào)控作用,旨在更深刻了解心臟HERG鉀通道的調(diào)控機理,為LQTS的治療提供新思路。
　　目的:闡明FHL2對心臟HERG鉀通道道白表達水平的調(diào)控作用,進一步明確FHL2對心臟HERG鉀通道功能的影響作用。
　

4、　方法:(1)以PCR法擴增FHL2基因的開放閱讀框(openreadingframe,ORF),并分別在其5’端及3’端加上EcoRI和XhoI酶切位點,將其克隆進入載體pcDNA3.0構(gòu)建重組質(zhì)粒pcDNA3.0-FHL2。(2)原代乳鼠心肌細胞的培養(yǎng):取出生24h內(nèi)大鼠左心室,剪碎,0.25%胰蛋白酶分離,離心收集心肌細胞,差速貼壁法和化學試劑法抑制非心肌細胞生長,純化后培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基。(3)利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將重組質(zhì)粒pcD

5、NA3.0-FHL2、針對人類FHL2的siRNA分別轉(zhuǎn)染乳鼠原代心肌細胞。(4)將轉(zhuǎn)染后乳鼠心肌細胞提取的蛋白用Westernblot檢測蛋白質(zhì)表達水平:分別加入FHL2一抗(鼠來源)和HERG一抗(羊來源),驗證FHL2對HERG鉀通道蛋白表達的影響。(5)FHL2和HERG在HEK-293細胞的表達:應(yīng)用脂質(zhì)體Lipofectamine2000將重組質(zhì)粒pcDNA3.0-HERG轉(zhuǎn)染HEK-293細胞,以及將pcDNA3.0-FH

6、L2、pcDNA3.0-HERG共轉(zhuǎn)染HEK-293細胞,免疫熒光細胞化學分析,應(yīng)用抗HERG和抗FHL2的抗體顯示HERG及FHL2的細胞定位。(6)在HEK-293細胞中,利用膜片鉗技術(shù),研究FHL2對HERG鉀通道功能的影響。
　　結(jié)果:(1)成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pcDNA3.0-FHL2,酶切鑒定及測序結(jié)果正確。(2)針對FHL2的siRNA通過Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染乳鼠原代心肌細胞后,Westernblot檢

7、測FHL2蛋白的表達量減少,而轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pcDNA3.0-FHL2的乳鼠心肌細胞,Westernblot檢測FHL2蛋白的表達量增加。(3)FHL2蛋白抑制表達時,HERG鉀通道蛋白表達量減少;FHL2過度表達時,HERG鉀通道蛋白表達量增加。(4)膜片鉗檢測發(fā)現(xiàn),在HEK-293細胞單獨表達HERG時,電流為400±30pA,同時表達HERG和FHL2時,電流增加到839±44pA,兩組之間進行t檢驗,t=-30.614,p=0.0