蛋白酪氨酸磷酸酶非受體型12與心臟HERG鉀通道相互作用并調(diào)控通道功能的研究.pdf

1、背景:由人類果蠅相關(guān)基因――HERG(Humanether-a-go-go-relatedgene)編碼的心臟HERG鉀通道屬于電壓依賴性鉀通道,介導(dǎo)快速激活延遲整流鉀電流(rapidlyactivateddelayedrectifierpotassiumcurrents,Ikr)。HERG鉀通道是心臟正常電活動(dòng)的基礎(chǔ),HERG基因突變及藥物阻斷該通道后可導(dǎo)致長QT綜合征(thelongQTsyndrome,LQTS)。目前已發(fā)現(xiàn)10個(gè)

2、與LQTS相關(guān)基因。其中,HERG突變可以導(dǎo)致第二型的LQTS(LQT2),是LQTS的第二常見原因。而蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用是很多細(xì)胞功能的重要基礎(chǔ),信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞周期調(diào)控、RNA轉(zhuǎn)錄、DNA復(fù)制、蛋白質(zhì)翻譯、蛋白質(zhì)翻譯后加工及修飾等功能的完成都依賴于蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)的相互作用。近年已報(bào)道一些蛋白質(zhì)與HERG鉀通道存在相互作用并調(diào)控該通道蛋白的表達(dá)、轉(zhuǎn)運(yùn)及功能。本課題組前期研究應(yīng)用酵母菌雙雜交技術(shù)初步篩選出與HERG鉀通道蛋白氨基末端存

3、在相互作用的15個(gè)蛋白質(zhì),包括:蛋白酪氨酸磷酸酶非受體型12(Tyrosine-proteinphosphatasenon-receptortype12,PTPN12)、caveolin-1、FHL2、Myotrophin蛋白等,其中的PTPN12可能對HERG鉀通道具有重要的調(diào)控作用,進(jìn)一步證明PTPN12與心臟HERG鉀通道存在相互作用,并闡明PTPN12對HERG鉀通道功能是否存在調(diào)控作用,為開發(fā)治療HERG鉀通道異常所致心律失常

4、的蛋白質(zhì)藥物奠定基礎(chǔ)。
　　目的:鑒定HERG鉀通道的相互作用蛋白,研究PTPN12對HERG鉀通道功能的調(diào)控作用。
　　方法:(1)應(yīng)用免疫共沉淀技術(shù)進(jìn)一步驗(yàn)證酵母雙雜交所篩選蛋白與HERG之間的相互作用:將抗HERG特異性抗體和總蛋白進(jìn)行混合,再加入ProteinA/GPlus-Agarose進(jìn)行混合,離心沉淀,將沉淀物進(jìn)行電泳,隨后應(yīng)用抗PTPN12抗體進(jìn)行WesternBlot分析。(2)GSTpull-down分析

5、:應(yīng)用GST-HERGT-NT融合蛋白和谷光苷肽-瓊脂糖4B小球從大鼠心肌裂解物中沉淀蛋白質(zhì),應(yīng)用抗PTPN12抗體對沉淀物進(jìn)行WesternBlot分析;(3)免疫熒光組織化學(xué)分析:培養(yǎng)HEK293細(xì)胞,應(yīng)用Lipofectamine2000將pcDNA3.1-PTPN12質(zhì)粒和pcDNA3.0-HERG質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞,轉(zhuǎn)染48小時(shí)后固定,應(yīng)用抗PTPN12和抗HERG的抗體和熒光標(biāo)記二抗顯示PTPN12及HERG的亞細(xì)胞

6、定位,應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡觀察。(4)應(yīng)用膜片鉗技術(shù),研究PTPN12對HERG鉀通道功能的影響。
　　結(jié)果:(1)免疫共沉淀分析發(fā)現(xiàn)抗HERG的抗體能夠沉淀HERG和PTPN12復(fù)合物;(2)應(yīng)用GSTpull-down分析發(fā)現(xiàn)GST-HERG-NT能夠?qū)TPN12沉淀,而GST蛋白則不能沉淀PTPN12;(3)免疫熒光組織化學(xué)分析:用倒置熒光顯微鏡觀察可見在細(xì)胞膜上PTPN12蛋白和HERG蛋白分別發(fā)出綠色熒光和紅色熒光,二

7、者熒光重疊部分(黃色熒光)提示這兩種蛋白在細(xì)胞上共定位,發(fā)現(xiàn)PTPN12和HERG兩個(gè)蛋白共定位的地方主要出現(xiàn)在細(xì)胞膜。(4)膜片鉗檢測發(fā)現(xiàn),PTPN12蛋白能降低HERG電流幅度。
　　結(jié)論:本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明蛋白酪氨酸磷酸酶非受體型12(PTPN12)與心臟HERG鉀通道的氨基末端存在相互作用,并通過這種相互作用發(fā)揮了調(diào)控HERG鉀通道功能的作用,使HERG鉀通道電流振幅降低。本結(jié)果提示PTPN12參與了HERG鉀通道功能的調(diào)控,