ClC-7影響牙發(fā)生的體內(nèi)研究.pdf

1、在前期課題組的臨床和基礎(chǔ)研究中,我們發(fā)現(xiàn)牙的發(fā)育和ClC-7分子密切相關(guān)。一方面表現(xiàn)在CLCN7基因突變所引起的骨硬化癥患者,可出現(xiàn)牙根發(fā)育不全及牙萌出受阻,部分牙有釉質(zhì)發(fā)育不全等異常表現(xiàn);另一方面,CLC-7蛋白在胚胎時(shí)期小鼠及出生后P1小鼠的牙胚中均有表達(dá)。所以,我們認(rèn)為ClC-7在牙發(fā)育中可能起到了非常重要的作用。為驗(yàn)證該假說,本實(shí)驗(yàn)采用殼聚糖作為siRNA載體,對(duì)Clcn7-siRNA進(jìn)行包裹,以保護(hù)siRNA免受核酸酶的降解及

2、提高細(xì)胞攝取率;然后通過頜骨局部注射CS-Clcn7-siRNA納米粒溶液的方法,使Clcn7-siRNA分布于特定牙胚及其周圍組織,從而觀察當(dāng)牙胚局部Clcn7基因水平下降時(shí),其牙胚發(fā)育的特征。
　　方法:
　　實(shí)驗(yàn)一:選取新生小鼠上頜第一磨牙為研究對(duì)象,進(jìn)行Cy5.5-siRNA的CS包裹后注射,通過小動(dòng)物活體成像技術(shù),比較腹腔注射和牙胚局部注射對(duì)牙胚局部的影響,探索和確定一種研究牙胚中基因的頜骨局部注射siRNA的方法

3、。
　　實(shí)驗(yàn)二:使用建立的頜骨局部注射法將CS-Clcn7-siRNA納米粒溶液局部注射于牙胚周圍,通過石蠟切片H&E染色和Micro-CT掃描,觀察注射后不同階段牙發(fā)育的特征,包括牙胚組織的相關(guān)細(xì)胞或結(jié)構(gòu),如成釉細(xì)胞、成牙本質(zhì)細(xì)胞、牙釉質(zhì)和牙本質(zhì)等的形成和變化規(guī)律,驗(yàn)證Clcn7在牙發(fā)育中的作用。
　　實(shí)驗(yàn)三:用免疫組化的方式比較對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組在CLC-7表達(dá)上的區(qū)別,判斷CS-siRNA納米粒溶液沉默Clcn7的有效性。

4、
　　結(jié)果:
　　1.CS-siRNA納米粒溶液腹腔注射后的熒光分布和強(qiáng)度:隨著時(shí)間的延長,熒光在腹腔內(nèi)的分布范圍先擴(kuò)大,后縮小;強(qiáng)度先增強(qiáng),后減弱。牙胚處始終沒有檢測出熒光分布。分離的上頜骨牙胚處不能檢測出熒光。
　　2.局部注射法的建立:首先,注射藍(lán)色染料后,探針挖出牙胚成藍(lán)色;其次,小動(dòng)物活體成像結(jié)果顯示,于左側(cè)上頜第一磨牙牙胚處注射CS-Cy5.5-siRNA納米粒溶液后,上頜骨牙胚處有熒光;最后,牙胚組織冰凍

5、切片在小動(dòng)物活體成像下顯示牙胚處有熒光,且 H&E染色結(jié)果顯示牙胚組織結(jié)構(gòu)完好。
　　3.石蠟切片H&E染色和Micro-CT結(jié)果顯示,實(shí)驗(yàn)組牙胚的成釉細(xì)胞和成牙本質(zhì)細(xì)胞受到影響,牙釉質(zhì)、牙本質(zhì)發(fā)育和牙萌出障礙,牙形態(tài)結(jié)構(gòu)紊亂。
　　4.P4小鼠石蠟切片免疫組化染色結(jié)果顯示,對(duì)照組小鼠CLC-7蛋白在牙胚內(nèi)的成釉細(xì)胞陽性結(jié)果表達(dá)最強(qiáng),成牙本質(zhì)細(xì)胞和部分的牙乳頭細(xì)胞表達(dá)其次強(qiáng),星網(wǎng)狀層上的CLC-7表達(dá)相對(duì)較弱。實(shí)驗(yàn)組小鼠CL

6、C-7蛋白在牙胚內(nèi)部分的牙乳頭細(xì)胞、成牙本質(zhì)細(xì)胞、成釉細(xì)胞和星網(wǎng)狀層細(xì)胞內(nèi)陽性表達(dá)降低或不表達(dá)。
　　結(jié)論:
　　1.腹腔注射方法目前不能將CS-siRNA有效遞送至頜骨和牙胚組織。局部注射方法具有定位性強(qiáng)和效應(yīng)局限等特征,可用于降低小鼠上頜第一磨牙的局部基因表達(dá)。
　　2.局部注射CS-Clcn7-siRNA用以沉默牙胚中Clcn7基因的方法可行,此方法為研究小鼠牙胚中其他基因的作用提供了新的研究途徑。
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7、.Clcn7基因局部沉默后可影響牙釉質(zhì)和牙本質(zhì)的發(fā)育、牙形態(tài)、牙根的發(fā)育和牙的萌出。
　　本課題通過局部注射CS-Clcn7-siRNA的方法,首次將CS-siRNA應(yīng)用于頜骨局部,有效地觀察了Clcn7基因在局部沉默后對(duì)牙胚發(fā)育的影響。我們認(rèn)為Clcn7基因可能是通過成釉細(xì)胞和成牙本質(zhì)細(xì)胞對(duì)牙釉質(zhì)和牙本質(zhì)的形成產(chǎn)生影響;通過對(duì)牙乳頭形態(tài)的影響,參與調(diào)控牙形態(tài)特征;通過影響牙胚周圍組織和細(xì)胞,影響牙根發(fā)育。本課題不僅通過載體包裹s