缺氧影響胃腺癌循環(huán)腫瘤細胞發(fā)生的體內實驗研究.pdf

1、目的:
　　本實驗第一部分通過體外培養(yǎng)腫瘤細胞加標回收實驗(spike recovery)來評價應用密度梯度離心法聯(lián)合CK19細胞免疫熒光法進行循環(huán)腫瘤細胞(circulationtumor cells，CTCs)富集/鑒定的回收率、特異性及敏感性;第二部分探討微環(huán)境缺氧的變化與胃腺癌循環(huán)腫瘤細胞發(fā)生之間的相關性。
　　方法:
　　1、應用體外培養(yǎng)細胞加標回收實驗(spike recovery)來評價CTCs富集、鑒定

2、的回收率、特異性及敏感性:即常規(guī)培養(yǎng)人低分化胃腺癌BGC-823細胞，于顯微鏡下利用無菌PBS調整細胞濃度至100個/ml，加此細胞懸液100 ul至10 ml健康志愿者血液中（每份血液含人低分化胃腺癌BGC-823細胞數(shù)為10個），采用密度梯度離心法富集CTCs，以抗角化蛋白(CK19)為標記物行細胞免疫熒光鑒定并計數(shù)CTCs，分別對健康志愿者及胃癌患者外周血CTCs進行富集及鑒定，通過兩組差異來評價該方法的回收率、特異性及敏感性。<

3、br>　　2、人低分化胃腺癌BGC-823細胞經不同終濃度CoCl2(0、100、200、300、400 umol/L)處理4h后，應用Western Blot檢測缺氧誘導因子-1α(hypoxia-inducible factor-1 alpha，HIF-1α)表達水平來篩選最適濃度。
　　3、將60只BALB/C小鼠隨機分為三組:缺氧組，常氧組、對照組（生理鹽水），每組20只，采用終濃度200 umol/L CoCl2處理BG

4、C-823細胞4h組作為缺氧組，無血清培養(yǎng)基處理BGC-823細胞4h組作為常氧組，鼠尾靜脈注射上述處理胃癌細胞，注射成功3天后，內眥靜脈采血1ml于EDTA抗凝管中，用上述方法進行CTCs富集、鑒定及計數(shù)。
　　結果:
　　1、培養(yǎng)細胞加標回收實驗顯示該方法的平均回收率為75％;10名健康志愿者血液均無CTCs檢出，而20名胃癌患者中，CTCs數(shù)目為0者占所檢測患者的40％，CTCs數(shù)目大于1個者占所檢測患者的60％，即C

5、TCs陽性檢出率為60％。
　　2、BGC-823細胞經終濃度200 umol/L CoCl2模擬缺氧4h后HIF-1α表達水平最高，與其他不同終濃度處理的細胞相比，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　3、CTCs發(fā)生與缺氧明顯相關，缺氧組小鼠CTCs檢出數(shù)量較常氧組增高(4.70±1.86 vs1.15±0.67, P=0.000)。
　　結論:
　　1、基于密度梯度離心法、CK19細胞免疫熒光法的循環(huán)腫