轉(zhuǎn)錄因子HOXB7對多發(fā)性骨髓瘤發(fā)生、發(fā)展的影響及其機(jī)制的研究.pdf

1、背景：
　　多發(fā)性骨髓瘤(MM)是一種中老年人多見的疾病，而且它是目前認(rèn)為無法治愈的一種血液系統(tǒng)腫瘤，一般表現(xiàn)為惡性漿細(xì)胞的增生，同時(shí)還伴有骨痛、乏力等其他非特異性的臨床癥狀，早期一般不易被發(fā)現(xiàn)，它一般可以侵犯骨骼，出現(xiàn)骨質(zhì)的損害，同時(shí)也可以出現(xiàn)其他器官的損傷，其他臟器也會(huì)不同程度的累及，如甲狀腺、消化系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)，如果侵犯到心臟及肺臟時(shí)，甚至可以侵犯到心包或胸腔等組織，從而進(jìn)一步引起全身多臟器損害，進(jìn)一步引起代謝的紊亂，以及免

2、疫功能的異常[1]?，F(xiàn)階段，我們主要采取化學(xué)治療和造血干細(xì)胞的移植的方法治療多發(fā)性骨髓瘤。雖然目前有各種新藥的出現(xiàn)，緩解率及生存率有所提高，但最終會(huì)病情復(fù)發(fā)，但對于患者來說患者生存質(zhì)量有待提高，長期生存不理想，同時(shí)由于病情反復(fù)、進(jìn)展導(dǎo)致治療效果差，同時(shí)腫瘤的易侵襲性，加之多發(fā)耐藥這一普遍現(xiàn)象的存在，同時(shí)還有其他因素等原因，迫使我們要更深入的研究多發(fā)性骨髓瘤的新的致病基因及發(fā)病機(jī)制，來提升患者的治療療效。難治導(dǎo)致的治療失敗需要我們尋求新的

3、細(xì)胞信號傳導(dǎo)通路及致病因素以找到新的治療靶點(diǎn)，因?yàn)槟[瘤極容易復(fù)發(fā)及侵襲性的特點(diǎn)，更需要找到影響浸潤、進(jìn)展的致病基因及相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子。故目前我們研究的焦點(diǎn)在防止腫瘤進(jìn)展、浸潤上。
　　目前大多數(shù)研究認(rèn)為多發(fā)性骨髓瘤與血管新生有關(guān)，它的發(fā)生、發(fā)展及髓外浸潤與相關(guān)的細(xì)胞信號傳導(dǎo)通路失活有關(guān)，同時(shí)與異常的細(xì)胞生物遺傳學(xué)有關(guān)，既往研究表明多發(fā)性骨髓瘤的發(fā)生是一種多因素的事件，這些因素相互關(guān)聯(lián)，相互影響及作用促進(jìn)瘤細(xì)胞的生成及腫瘤的進(jìn)程。多發(fā)性

4、骨髓瘤的明確的致病因素目前需要進(jìn)一步深入探討，在研究的過程當(dāng)值，發(fā)現(xiàn)了許多基因的高表達(dá)或者是某些特定基因的低表達(dá)，這些基因的異常表達(dá)可能與多發(fā)性骨髓瘤的發(fā)生有密切關(guān)系。資料顯示，有一些細(xì)胞因子的分泌會(huì)直接刺激骨髓瘤細(xì)胞生長及增殖，這些細(xì)胞因子常常位于瘤細(xì)胞中或者微環(huán)境中的基質(zhì)細(xì)胞中，目前認(rèn)為與多發(fā)性骨髓瘤發(fā)病關(guān)系較密切的細(xì)胞因子有：血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)，如MMP-2與MMP-9，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)以下細(xì)胞因子

5、對瘤細(xì)胞有促進(jìn)增殖及浸潤的作用，包括：成纖維生長因子（bFGF）、白介素-8、血管生成素-1、骨橋蛋白(OPN)等。這些細(xì)胞因子可能受到某些細(xì)胞信號的刺激后，會(huì)分泌有所增加，同時(shí)與某些特定的癌基因相互作用，它們均有促進(jìn)血管新生作用[2]。國內(nèi)外的一些研究已經(jīng)證實(shí)HOXB7基因可特異性誘導(dǎo)bFGF、GROa、VEGF等血管生長因子表達(dá)水平上調(diào),激活PI3K/Akt信號傳導(dǎo)途徑，抑制內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡，然后進(jìn)一步促進(jìn)腫瘤血管生成、腫瘤的生長與轉(zhuǎn)

6、移。HOXB7基因促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移及腫瘤細(xì)胞的血管生成等作用，在多種實(shí)體腫瘤細(xì)胞中已經(jīng)得到證實(shí)，而其在造血系統(tǒng)腫瘤及造血細(xì)胞中的作用尚不清楚，關(guān)于HOXB7是否與多發(fā)性骨髓瘤的發(fā)生以及骨髓瘤的進(jìn)展、浸潤相關(guān)的資料較少，故是我們所研究的重點(diǎn)。
　　因此，本文研究了轉(zhuǎn)錄因子HOXB7在不同臨床分期的多發(fā)性骨髓瘤患者中的作用，同時(shí)檢測了一系列相關(guān)基因的表達(dá)，為了更深入的明確HOXB7因子的作用，并了解HOXB7因子是否與多

7、發(fā)性骨髓瘤發(fā)生、發(fā)展及浸潤相關(guān)。同時(shí)通過HOXB7-siRNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞，使HOXB7因子的表達(dá)降低，從而對其他相關(guān)基因進(jìn)行分子生物學(xué)的檢測，比較轉(zhuǎn)染前后表達(dá)的變化，明確多發(fā)性骨髓瘤致病基因，并為進(jìn)一步治療多發(fā)性骨髓瘤提供理論基礎(chǔ)，從而闡述HOXB7基因可能與骨髓瘤的進(jìn)展密切相關(guān)。
　　國內(nèi)外關(guān)于HOXB7與多發(fā)性骨髓瘤的關(guān)系方面，這一領(lǐng)域的研究相對較少，在此研究中，我們發(fā)現(xiàn)HOXB7基因在一部分多發(fā)性骨髓瘤患者中有

8、表達(dá)，同時(shí)存在表達(dá)的患者容易出現(xiàn)病情進(jìn)展及髓外浸潤，具有潛在的促血管新生及促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用，對多發(fā)性骨髓瘤的病情進(jìn)展有促進(jìn)作用。通過siRNA轉(zhuǎn)染多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞，使HOXB7基因下調(diào)，檢測其他相關(guān)基因的表達(dá)情況，進(jìn)一步說明它在多發(fā)性骨髓瘤中的作用，尋找治療多發(fā)性骨髓瘤的新的靶點(diǎn)。把研究分為三部分：
　　第一部分：轉(zhuǎn)錄因子HOXB7在多發(fā)性骨髓瘤患者中的臨床意義
　　目的：
　　應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法檢測多發(fā)性

9、骨髓瘤患者中HOXB7mRNA及其應(yīng)用Westernblot的方法檢測其蛋白水平，闡述它在多發(fā)性骨髓瘤中的作用機(jī)制，并且純化分離多發(fā)性骨髓瘤患者的骨髓單個(gè)核細(xì)胞，并分析MM患者中HOXB7因子在不同的多發(fā)性骨髓瘤臨床階段的情況，明確HOXB7與骨髓瘤的進(jìn)展及髓外浸潤的關(guān)系。
　　方法：
　　采用CD138抗體把MM細(xì)胞進(jìn)行分離純化臨床收集的49例MM患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞，并同時(shí)取患者骨髓組織及骨髓上清液，采用20例缺鐵性貧血患

10、者作為對照組，將患者按Durie-Salmon分期和是否伴有髓外浸潤進(jìn)行分組，進(jìn)行分析。應(yīng)用免疫組化的方法進(jìn)行骨髓組織的化學(xué)染色，并用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(FQ-PCR)法檢測HOXB7的表達(dá)，Western blot法測定其蛋白表達(dá)水平，用ELISA的方法檢測骨髓上清液中的蛋白含量
　　結(jié)果：
　　1.49例MM患者中，其中有35例MM患者表達(dá)HOXB7 mRNA，其表達(dá)水平為（0.466±0.148），20例對照組的表達(dá)水

11、平為（0.179±0.061），二者相比有顯著差異（P＜0.01）。
　　我們應(yīng)用Durie-Salmon分期，把MM患者分為兩組。Ⅰ+Ⅱ期和Ⅲ期。其中Ⅰ+Ⅱ期MM患者組21例，HOXB7 mRNA表達(dá)水平為（0.372±0.131）。Ⅲ期MM患者組28例，HOXB7 mRNA表達(dá)水平為（0.561±0.099），并把Ⅰ+Ⅱ期和Ⅲ期MM患者組分別與對照組做比較，結(jié)果顯示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），而把Ⅰ+Ⅱ期MM患者組和Ⅲ期MM

12、患者組進(jìn)行比較后，結(jié)果顯示差異顯著（P=0.018；P<0.05）。
　　在所有MM患者的標(biāo)本中行WNT5A mRNA的檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)WNT5A mRNA的表達(dá)水平為：（0.588±0.225），對照組的表達(dá)水平為（0.192±0.011），Ⅰ+Ⅱ期和Ⅲ期MM患者組的表達(dá)水平分別為（0.426±0.133），（0.751±0.176），兩者相比后顯示，差異顯著（P=0.005；P<0.01），與對照組比較后結(jié)果顯示P<0.01，差

13、異顯著，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　在所有MM患者的標(biāo)本中行VEGFA,MMP2,bFGF,MMP9,CyclinD1mRNA的表達(dá)水平的檢測，Ⅰ+Ⅱ期患者的表達(dá)水平分別為（0.826±0.327），（1.726±0.462），（1.026±0.215），（0.735±0.109），（1.726±0.319），Ⅲ期MM患者組為（1.204±0.662），（2.336±0.421），（2.273±0.406），（2.261±0.520），（

14、1.836±0.402），與對照組比較（P<0.05），把Ⅰ+Ⅱ期MM患者組和Ⅲ期MM患者組進(jìn)行比較后，結(jié)果顯示差異顯著（P<0.01）。
　　2.在III期MM患者中，其中伴有髓外浸潤的患者有9例，不伴有髓外浸潤的患者有19例，其中伴有髓外浸潤的患者的HOXB7mRNA的表達(dá)為（0.751±0.176），不伴有髓外浸潤的HOXB7mRNA患者表達(dá)為（0.639±0.051），經(jīng)過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示差異顯著（P<0.05），WNT5A

15、 mRNA在伴有髓外浸潤的患者的表達(dá)為（0.896±0.105），不伴有髓外浸潤的患者表達(dá)為（0.605±0.056）。二者與對照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，（P<0.01）。二者相比，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析有顯著差異（P<0.05）。
　　3.根據(jù)NCCN指南里治療多發(fā)性骨髓瘤中，多發(fā)性骨髓瘤患者的治療的療效標(biāo)準(zhǔn)，把多發(fā)性骨髓瘤患者分為newly diagnosed，sCR，CR，VGPR，PR，SD，progressive disease，cli

16、nical relapse，and relapse from CR.對MM患者行Western blot的檢測。Newly diagnosed（初治）MM患者20例，sCR MM患者5例，CR MM患者3例，VGPR MM患者1例,PR MM患者2例,SD MM患者5例，共計(jì)16例病情穩(wěn)定的患者，progressive disease MM患者3例,clinical relapse MM患者6例，relapse from CR MM患者

17、4例，共計(jì)13例復(fù)發(fā)及病情進(jìn)展的MM患者。
　　在49例MM患者選取Newly diagnosed、（sCR及CR、VGPR、PR、SD）MM患者、（progressive disease，clinical relapse，and relapse from CR） MM患者各6例，對照組選取10例，其中10例對照組HOXB7蛋白平均表達(dá)水平為（0.075±0.026），18例MM患者的HOXB7蛋白的平均表達(dá)水平為（0.268±0

18、.127），其中Newly diagnosed組HOXB7蛋白的平均表達(dá)水平為（0.278±0.050），（sCR及CR、VGPR、PR、SD）組MM患者與（progressivedisease，clinical relapse，and relapse from CR） MM患者組HOXB7蛋白的平均表達(dá)水平為分別為（0.199±0.039），（0.327±0.131）。初治的MM患者與復(fù)發(fā)、病情進(jìn)展的MM患者，分別與病情穩(wěn)定的MM患者

19、相比較，結(jié)果顯示有差異顯著（P<0.01)。而把初治MM患者與復(fù)發(fā)及病情進(jìn)展的MM患者相比較后，結(jié)果顯示無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05)。初治患者組、復(fù)發(fā)及病情進(jìn)展的MM患者分別與對照組比較，結(jié)果有顯著差異（P<0.01）。
　　在選取的這些患者中其中Ⅰ+Ⅱ期MM患者組6例，HOXB7平均表達(dá)水平為（0.216±0.047）。Ⅲ期MM患者組12例，HOXB7蛋白平均表達(dá)水平為（0.320±0.114），并把Ⅰ+Ⅱ期和Ⅲ期MM患者組分別

20、與對照組做比較，結(jié)果顯示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），而把Ⅰ+Ⅱ期MM患者組和Ⅲ期MM患者組進(jìn)行比較后，結(jié)果顯示差異顯著（P<0.01）。
　　WNT5A蛋白在Ⅰ+Ⅱ期MM患者的平均表達(dá)水平為（0.398±0.136），Ⅲ期MM患者組平均表達(dá)水平為（0.549±0.142），與對照組表達(dá)水平有顯著差異P<0.05，二者比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P<0.01。
　　4.對Newly diagnosed、（sCR及CR、VGPR、PR、S

21、D）MM患者、（progressive disease，clinical relapse，and relapse from CR）MM患者各6例行WNT5a，VEGFA，MMP-2，β-catenin，MMP-9，CyclinD1，survivin蛋白的檢測，其中MMP-2、β-catenin、VEGFA、MMP-9蛋白在Newly diagnosed和（progressive disease，clinical relapse，and

22、relapse from CR） MM患者中的平均表達(dá)水平明顯高于（sCR及CR、VGPR、PR、SD） MM患者中的平均表達(dá)水平，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，差異顯著（P<0.01），與對照組比較，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　5.我們按照多發(fā)性骨髓瘤的患者是否伴有髓外浸潤，將所有的多發(fā)性骨髓瘤患者分為兩組。把12例III期MM患者中4例無髓外浸潤的MM患者和8例伴髓外浸潤的MM患者檢測HOXB7蛋白水平，平均表達(dá)水平分別為（0.265

23、±0.085）和（0.389±0.051），分別與對照組比較，差異顯著，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，二者之間比較，有明顯差異（P<0.05）。WNT5A蛋白在無髓外浸潤的MM患者中的平均蛋白水平為（0.441±0.075），伴髓外浸潤的MM患者的WNT5A蛋白平均表達(dá)水平（0.673±0.0.185）,分別與對照組比較，差異顯著，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，二者之間比較，有明顯差異（P<0.01）。二者經(jīng)過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示（P<0.01）,差異顯著。
　　6.

24、免疫組化染色HOXB7、VEGFA、β-catenin、WNT5a蛋白
　?、倜庖呓M化染色HOXB7蛋白結(jié)果：在I+II期患者中，有1例顯示低表達(dá)，陽性率為5％，有2例高表達(dá)，陽性率為10%，在III期患者中，有5例呈現(xiàn)低表達(dá)水平，10例患者為高表達(dá)，陽性率分別為，17.9%，35.7%，兩組MM患者經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析有明顯差異，（P<0.01）。III期MM患者的陽性率明顯高于I+II期患者。在20例對照組中病例中有1例表達(dá)陽性，陽性

25、率為5%，與對照組比較存在明顯差異（P<0.05）。
　?、诿庖呓M化染色VEGFA蛋白結(jié)果：在I+II期患者中，有3例顯示低表達(dá)，陽性率為14.2%，有4例高表達(dá)，陽性率為16%，在III期患者中，有7例呈現(xiàn)低表達(dá)水平，11例患者為高表達(dá)，陽性率分別為，25%，39.3%，兩組MM患者經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析有明顯差異，（P<0.05）。III期MM患者的陽性率明顯高于I+II期患者。在20例對照組中病例中有2例表達(dá)陽性，陽性率為10%，與對

26、照組比較存在明顯差異（P<0.05）。
　?、勖庖呓M化染色β-catenin蛋白結(jié)果：在I+II期患者中，有1例顯示低表達(dá)，陽性率為5%，沒有高表達(dá)，陽性率為0%，在III期患者中，有3例呈現(xiàn)低表達(dá)水平，5例患者為高表達(dá)，陽性率分別為10.7%，17.9%，兩組MM患者經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析有明顯差異，（P<0.01）。III期MM患者的陽性率明顯高于I+II期患者。對照組中無陽性表達(dá)，與對照組比較存在明顯差異（P<0.05）。
　　

27、④免疫組化染色WNT5a蛋白結(jié)果：在I+II期患者中，有3例顯示低表達(dá)，陽性率為14.2%，高表達(dá)患者有4例，陽性率為16%，在III期患者中，有7例呈現(xiàn)低表達(dá)水平，11例患者為高表達(dá)，陽性率分別為25%，39.3%，兩組MM患者經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析有明顯差異，（P<0.01）。III期MM患者的陽性率明顯高于I+II期患者。對照組中2例陽性表達(dá)，與對照組比較存在明顯差異（P<0.05）。
　　應(yīng)用Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示，HOXB

28、7蛋白與WNT5A蛋白呈正相關(guān)，HOXB7蛋白與VEGFA蛋白呈正相關(guān)。
　　7.用ELISA的方法檢測骨髓上清液
　　在所有MM患者中，檢測骨髓上清中IL-6、VEGF、MMP-2、MMP-9 CyclinD1、β-catenin蛋白含量，結(jié)果顯示蛋白平均含量明顯高于對照組,兩者進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，差異顯著(P<0.05)。初治與復(fù)發(fā)進(jìn)展MM患者IL-6蛋白含量明顯高于病情穩(wěn)定MM患者，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示差異顯著(P<0.05

29、)；
　　結(jié)論：
　　HOXB7基因及蛋白與WNT5a基因與蛋白在多發(fā)性骨髓瘤患者的不同分期中表達(dá)水平不同，III期的MM患者的表達(dá)較高。初治MM患者、復(fù)發(fā)及病情進(jìn)展MM患者的表達(dá)水平與病情穩(wěn)定患者比較有差異，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。二者在在髓外浸潤的患者中表達(dá)高于無髓外浸潤的MM患者，考慮MM患者中如果存在HOXB7與WNT5a表達(dá)，可能容易出現(xiàn)髓外浸潤或者進(jìn)展，故其表達(dá)水平可能與MM患者疾病的進(jìn)展有關(guān)，并促進(jìn)血管新

30、生及髓外浸潤。此外在高表達(dá)的HOXB7與WNT5a的患者中，伴隨其他促血管新生及促細(xì)胞增殖的相關(guān)指標(biāo)的表達(dá)。
　　第二部分：轉(zhuǎn)錄因子HOXB7促進(jìn)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株RPMI8226增殖及應(yīng)用小干擾RNA后對RPMI8226細(xì)胞的影響
　　目的：
　　應(yīng)用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的方法，采用HOXB7-siRNA轉(zhuǎn)染RPMI8226細(xì)胞，使HOXB7基因表達(dá)下降，進(jìn)一步探討HOXB7基因?qū)PMI8226細(xì)胞增殖影響的機(jī)制，明確HOXB

31、7基因在RPMI8226細(xì)胞株中的作用。
　　方法：
　　采用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的方法，把特異的HOXB7-siRNA進(jìn)行轉(zhuǎn)染至RPMI8226細(xì)胞，抑制細(xì)胞內(nèi)HOXB7基因的表達(dá)。應(yīng)用熒光定量PCR（FQ-PCR）方法檢測HOXB7 mRNA水平以及WNT5A mRNA，MMP-2 mRNA，MMP-9 mRNA，β-catenin mRNA表達(dá)水平變化。并采用Western Blot的方法檢測上述蛋白水平。轉(zhuǎn)染后使用MTT的方法檢

32、測小干擾RNA對細(xì)胞活力的影響；同時(shí)應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測小干擾RNA對細(xì)胞周期的影響；
　　結(jié)果：
　　1.HOXB7-siRNA在轉(zhuǎn)染RPMI8226細(xì)胞株48h后，HOXB7 mRNA表達(dá)水平明顯受到抑制，HOXB7-siRNA轉(zhuǎn)染組的表達(dá)水平為0.329±0.047，negative control-siRNA轉(zhuǎn)染組為0.985±0.136，HOXB7-siRNA轉(zhuǎn)染組的表達(dá)水平分別與陰性對照組和空白對照相比，差異顯著，

33、有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。
　　2.用Western blot法檢測HOXB7蛋白表達(dá)水平，轉(zhuǎn)染24小時(shí)，HOXB7-siRNA轉(zhuǎn)染組的蛋白表達(dá)水平為0.068±0.002，negative control-siRNA轉(zhuǎn)染組的蛋白表達(dá)水平為0.619±0.118，HOXB7-siRNA轉(zhuǎn)染組的表達(dá)水平分別與陰性對照組和空白對照相比，存在明顯差異，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。
　　3.HOXB7-siRNA轉(zhuǎn)染RPMI8

34、226細(xì)胞后RPMI8226細(xì)胞增殖影響MTT法檢測RPMI8226細(xì)胞轉(zhuǎn)染后的生長情況。通過繪制生長曲線，細(xì)胞轉(zhuǎn)染 HOXB7-siRNA48h，細(xì)胞的生長抑制較明顯， negative control-siRNA轉(zhuǎn)染組和HOXB7-siRNA轉(zhuǎn)染組OD490值比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。
　　4.HOXB7-siRNA轉(zhuǎn)染RPMI8226細(xì)胞后細(xì)胞周期的變化。細(xì)胞周期分析顯示HOXB7-siRNA轉(zhuǎn)染RPMI8226細(xì)胞

35、48h后，細(xì)胞阻止于G2期，處于G0/G1期細(xì)胞比例降低，G2/M期和S期細(xì)胞比例升高，凋亡峰顯示凋亡的細(xì)胞比例增加。
　　5.HOXB7-siRNA轉(zhuǎn)染RPMI8226細(xì)胞后48h，未轉(zhuǎn)染組、陰性對照轉(zhuǎn)染組、HOXB7-siRNA組，HOXB7 mRNA相對表達(dá)水平分別為1.058±0.341；1.128±0.315；0.142±0.045，negative control-siRNA組和HOXB7-siRNA組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

36、（P<0.01）。
　　MMP-2 mRNA相對表達(dá)水平分別為2.606±0.521；1.858±0.186；0.882±0.353（P<0.01）。MMP-9 mRNA相對表達(dá)水平分別為1.896±0.653；1.025±0.276；0.457±0.068；（P<0.05）。WNT5a mRNA相對表達(dá)水平分別為：1.016±0.195；1.002±0.206；0.507±0.026（P<0.01）。β-catenin mRNA

37、相對表達(dá)水平分別1.012±0.205；1.006±0.179；0.682±0.351（P<0.01）。negative control-siRNA和HOXB7-siRNA二組相比，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）
　　6.HOXB7-siRNA轉(zhuǎn)染RPMI8226細(xì)胞后48h，未轉(zhuǎn)染組、NS-siRNA組、HOXB7siRNA組，HOXB7蛋白相對表達(dá)水平分別為0.858±0.204，0.619±0.118和0.068±0.

38、021，negative control-siRNA組與HOXB7-siRNA組相比有顯著性差異（P<0.01）。
　　MMP-2蛋白相對表達(dá)水平分別為1.018±0.216；0.734±0.159；0.283±0.114（P<0.01）。MMP-9蛋白相對表達(dá)水平分別為1.236±0.253；1.022±0.259；0.453±0.098；（P<0.05）。WNT5a蛋白相對表達(dá)水平分別為：1.016±0.129；0.947±0

39、.221；0.207±0.028（P<0.01）。β-catenin蛋白相對表達(dá)水平分別1.154±0.205；1.006±0.179；0.682±0.351（P<0.01） negative control-siRNA和HOXB7-siRNA二組相比，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。
　　結(jié)論：
　　通過小干擾RNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HOXB7基因后，明顯抑制RPMI8226細(xì)胞增殖，而瘤細(xì)胞凋亡增加， HOXB7表達(dá)水平降低

40、后，WNT5A，MMP-2，MMP-9，β-catenin的表達(dá)也降低，可能與HOXB7表達(dá)水平降低，并進(jìn)一步引起凋亡相關(guān)基因分子以及是否與WNT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路信號分子異常有關(guān)。
　　第三部分：人參皂苷Rg3(Rg3)抑制RPMI8226細(xì)胞株和U266細(xì)胞株增殖的研究
　　目的：
　　研究人參皂苷Rg3對RPMI8226細(xì)胞株的增殖影響，并為臨床治療多發(fā)性骨髓瘤提供理論證據(jù)，并闡述人參皂苷Rg3發(fā)揮抑制多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞

41、的致病機(jī)制。
　　方法：
　　應(yīng)用CCK-8的方法檢測人參皂苷Rg3對RPMI8226細(xì)胞株和U266細(xì)胞株增殖抑制作用；采用流式細(xì)胞儀檢測人參皂苷Rg3對細(xì)胞周期分布；熒光定量PCR（FQ-PCR）和Western Blot的方法，檢測HOXB7mRNA，bcl-2 mRNA，bax mRNA，caspase-9 mRNA，caspase-8 mRNA和caspase-3 mRNA及蛋白水平的變化
　　結(jié)果：

42、　　1.CCK-8的方法檢測人參皂苷Rg3對人類多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株增殖抑制的影響。人參皂苷Rg3對U266細(xì)胞株和RPMI8226細(xì)胞株的抑制作用存在時(shí)間-劑量-依賴性，人參皂苷Rg3在80μg/ml作用于U266細(xì)胞48 h后，達(dá)到最大抑制水平。在一半最大抑制濃度(IC50)值為47.5 mg/mll。人參皂苷Rg3在RPMI8226(IC50=36.8μg/ml)細(xì)胞株中比U266細(xì)胞有更強(qiáng)的細(xì)胞增殖抑制作用。
　　2.流式細(xì)

43、胞儀檢測人參皂苷Rg3對細(xì)胞周期的影響。用20、40和80μg/ml的Rg3分別處理U266細(xì)胞和RPMI8226細(xì)胞株，結(jié)果顯示在G1期細(xì)胞群百分比增加，而S期的細(xì)胞群比例下降。然而，Rg3對G2/M期沒有影響。
　　3.Western Blot分析顯示經(jīng)過Rg3處理U266細(xì)胞后，HOXB7蛋白的表達(dá)有所降低，bcl-2蛋白的表達(dá)有所降低，bax蛋白的表達(dá)有所升高，并降低了bcl-2/bax的比率。同時(shí)檢測細(xì)胞凋亡-相關(guān)的蛋白

44、質(zhì)。Western Blot分析顯示Rg3增加了caspase-9,caspase-8和caspase-3蛋白表達(dá)。
　　結(jié)論：
　　人參皂苷Rg3能夠明顯抑制U266、RPMI8226的細(xì)胞活性與增殖作用，出現(xiàn)有時(shí)間-劑量-依賴性。降低了HOXB7的水平，同時(shí)增加了凋亡蛋白的表達(dá)，并且可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期蛋白-依賴激酶途徑導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯在G1期?？紤]Rg3可能促進(jìn)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞的凋亡，使Bcl-2/Bax蛋白的平衡失調(diào)